醋酸鉛對大鼠睪丸支持細胞ABP、INH和TfmRNA轉錄表達的影響.pdf

1、近年來,環(huán)境污染已成為十分突出的問題,重金屬是其中一類重要的污染物。鉛是人類最早開始使用的重金屬元素之一,因其應用廣泛,也造成了對環(huán)境的污染。鉛可對機體多個系統(tǒng)和器官造成損傷,并影響動物和人類的生殖功能。國內(nèi)外以往關于鉛雄性生殖毒性的研究主要集中在睪丸,因為睪丸為雄性最主要的生殖腺,并且是大多數(shù)外源化學物雄性生殖毒性的靶器官。
　　支持細胞是雄性動物睪丸曲細精管內(nèi)唯一的體細胞,在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。支持細胞離體培養(yǎng)模型由

2、于具有快速、經(jīng)濟、干擾少、實驗結果針對性強以及結果的可靠性和重現(xiàn)性好等特點,被廣泛應用于外源性毒物的生殖毒理學研究中。支持細胞被稱為生精細胞的“保姆細胞”,不僅在結構上為生精細胞的分化成熟提供支架,供給生精過程所需的能量及營養(yǎng)物質:同時可分泌數(shù)十種物質參與生精細胞的分化成熟,具有精細的協(xié)調(diào)作用,保證精子發(fā)生的正常有序進行。
　　支持細胞可分泌雄激素結合蛋白(androgen binding protein,ABP)、轉鐵蛋白(tr

3、ansferrin,Tf)和抑制素(inhibin,INH)等。ABP能夠轉運和儲存雄激素,使曲細精管內(nèi)維持高濃度的雄激素,生精細胞和精子均有結合和代謝ABP的能力;Tf可以為生精細胞提供生理活動和生化過程所需要的鐵,并且對細胞生長有直接的刺激作用;INH能夠抑制卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)的分泌,不僅在調(diào)節(jié)垂體-睪丸軸的平衡中起著必不可少的作用,而且在睪丸精細胞分化、發(fā)育過程中起著直接

4、的作用。
　　ABP、Tf和INH均被廣泛地用作支持細胞功能的標志。鉛能夠造成FSH的分泌異常,影響支持細胞內(nèi)第二信使的濃度,也能夠直接作用于支持細胞,影響支持細胞內(nèi)第二信使的生成。上述變化可能會影響到支持細胞內(nèi)基因的表達,造成支持細胞分泌功能的異常,產(chǎn)生雄性生殖毒性。
　　本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞,使其暴露于不同濃度的醋酸鉛,從mRNA水平上分析受試物對支持細胞表達ABP、INH和Tf的影響。以此探討支持細胞

5、在醋酸鉛造成的雄性生殖功能損傷中的作用,為進一步研究鉛的生殖毒性作用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立大鼠睪丸支持細胞體外原代培養(yǎng)模型。18~21日齡SD大鼠睪丸經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶依次消化,分離和純化支持細胞。在35℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng),并經(jīng)Feulgen染色進行支持細胞鑒定。利用MTT法描述支持細胞生長曲線。以DMEM/F-12培養(yǎng)基為溶劑配制醋酸鉛工作液,給予不同劑量對支持細胞染毒24h,確定醋酸鉛最大無細

6、胞毒性作用劑量。
　　2.醋酸鉛對ABP、INH和Tf基因轉錄的影響。以醋酸鉛濃度為0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L對離體原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細胞染毒24h,提取細胞內(nèi)總RNA,進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),以GAPDH為內(nèi)參照,檢測支持細胞內(nèi)ABP、INH和TfmRNA的水平。
　　3.統(tǒng)計學分析。運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(ana

7、lysis ofvariance,ANOVA)、Bonfferoni兩兩比較、Levene方差齊性檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析(檢驗水準α=0.05)。
　　結果:
　　1.本研究分離培養(yǎng)的支持細胞體外生長良好,且支持細胞純度比較高,可以用于體外實驗研究。不同濃度的醋酸鉛染毒體外培養(yǎng)第4d的支持細胞24h后,結果發(fā)現(xiàn)醋酸鉛濃度最高為10-5mol/L時無細胞毒性。
　　2.RT-PCR結果:
　　①以10-8mol/

8、L~10-5mol/L的醋酸鉛染毒支持細胞24h,ABP mRNA相對表達量均高于對照組,但是差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　?、谝?0-8mol/L~10-5mol/L的醋酸鉛染毒支持細胞24h,TfmRNA在10-8 mol/L、10-7mol/L和10-6 mol/L劑量組的相對表達量均高于對照組,10-5 mol/L劑量組的相對表達量低于對照組,但是各劑量組的基因相對表達量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.

9、05)。
　　③以10-8mol/L~10-5mol/L的醋酸鉛作用于支持細胞24h后,INH mRNA在10-8mol/L和10-7 mol/L劑量組的相對表達量低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10-6 mol/L劑量組的相對表達量低于對照組,10-5mol/L劑量組的相對表達量高于對照組,但是差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論:
　　1.醋酸鉛對原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞在10-8mol/

10、L~10-5mol/L劑量范圍內(nèi)未觀察到細胞毒性。
　　2.醋酸鉛在10-8mol/L~10-5mol/L劑量范圍內(nèi)對支持細胞雄激素結合蛋白和轉鐵蛋白的轉錄表達無影響,醋酸鉛在此劑量下不影響雄激素結合蛋白和轉鐵蛋白的分泌。
　　3.醋酸鉛在10-8mol/L和10-7 mol/L劑量下可減少支持細胞抑制素的轉錄表達。醋酸鉛在10-6 mol/L和10-5mol/L劑量下對抑制素的轉錄表達沒有影響。醋酸鉛可以改變抑制素的分泌,