“調(diào)肝腎、祛痰瘀”治法方藥逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的作用機(jī)理研究.pdf

1、第一部分理論探討: 一、血管重構(gòu)與原發(fā)性高血壓 血管對(duì)血壓始終都發(fā)揮著自身的重要調(diào)節(jié)作用。它能產(chǎn)生許多活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管的結(jié)構(gòu)和功能。因此，血管本身障礙及如何糾正這一障礙是高血壓發(fā)病機(jī)制及其防治中的一個(gè)重要問(wèn)題，而其關(guān)鍵又是糾正血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)結(jié)構(gòu)和功能的改變。 與高血壓伴隨的血管結(jié)構(gòu)和功能的變化，即是血管重構(gòu) (Vascular Remodeli

2、ng，VR)主要包括：①血管壁增厚，尤其是中層肥厚，導(dǎo)致壁與腔之間的比例明顯加大，血流阻力和血管對(duì)縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性增強(qiáng)；②阻力血管變得稀少，尤其是直徑12-25μm 的阻力血管數(shù)目明顯減少，隨之產(chǎn)生一系列血管功能異常。許多研究證實(shí)：高血壓阻力血管結(jié)構(gòu)變化與 VSMC 增生和肥大有關(guān)。VSMC 結(jié)構(gòu)的變化及血管壁肥厚在不同類(lèi)型的高血壓表現(xiàn)都較為相似，即通過(guò) VSMC 生長(zhǎng)和血管壁“重塑”共同作用的結(jié)果。 高血壓時(shí)VSMC 通過(guò)自

3、分泌、旁分泌和細(xì)胞內(nèi)分泌等多種方式分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)，如血小板源生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子—β<,1>(transforming growth factor β<,1>，TGF-β<,1>)，這在高血壓血管肥厚的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量實(shí)驗(yàn)證明鈣，尤其是VSMC內(nèi)游離Ca<'2+>，在維持細(xì)胞正常功能和許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用。血

4、管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的增多，被認(rèn)為是原發(fā)性高血壓發(fā)生機(jī)制的最后共同途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)CaCa<'2+>濃度升高后，CaCa<'2+>與其細(xì)胞內(nèi)受體鈣調(diào)素 (Calmodin，CaM)結(jié)合生成復(fù)合物，后者通過(guò)一系列磷酸化過(guò)程引起平滑肌細(xì)胞收縮，并可促進(jìn)多種癌基因的表達(dá)，如 c-fos、c-myc、c-myb 等，從而引起血管平滑肌肌細(xì)胞的增殖和肥厚。 二、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)的研究意義及研究概況 血管重構(gòu)與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病

5、等多種心血管的疾病的發(fā)病有密切的關(guān)系，可加速疾病的進(jìn)程。盡管目前血管重構(gòu)的機(jī)制尚未完全明確，但其有關(guān)機(jī)制以及逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)的研究已成為研究的熱點(diǎn)。 目前大多數(shù)合成藥物往往由于副作用，或是由于聯(lián)合用藥時(shí)的拮抗作用，或是由于長(zhǎng)期用藥所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，仍然處于不斷研究探索當(dāng)中；而中藥復(fù)方所表現(xiàn)出的整體調(diào)節(jié)作用，避免了化學(xué)藥物針對(duì)單一的病理環(huán)節(jié)，從而顯示出良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。本課題組長(zhǎng)期以來(lái)一直從事中醫(yī)“調(diào)肝腎，祛痰瘀”治法方藥防治高血

6、壓及其并發(fā)癥的研究，我們既往的研究工作表明“調(diào)肝腎，祛痰瘀”治法方藥對(duì)高血壓病具有良好的整體調(diào)節(jié)作用。 第二部分實(shí)驗(yàn)研究: 一、材料和方法 (一)藥物調(diào)肝腎、祛痰瘀中藥復(fù)方 (簡(jiǎn)稱(chēng)“調(diào)方”)，其組成為：熟地 25g、龜版 30g (打碎、先煎)、丹參15g、三七5g、鉤藤15g (后下)、全瓜萎 15g、懷牛膝 15g。所用中藥均由本校第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定為純正藥材。常規(guī)煎煮取汁后濃縮至含生藥1.

7、06g/ml。藥液常溫冷卻后，置 4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?(二)動(dòng)物分組及給藥1、整體療效學(xué)研究親代自發(fā)性高血壓大鼠 (Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)為 0048303，12 周齡，清潔級(jí)，其中雄性17只，體重250±25g，雌性34只，體重 160±25g。SHR 按體重及雄、雌1：2 的比例隨機(jī)分為4組。在測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓后同籠配對(duì)繁育，每籠1

8、雄2雌，每組4籠。 從6周起觀察血壓測(cè)量值；至12周取材，觀察血管中膜厚度及與管腔比值、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 2、離體培養(yǎng)VSMC重構(gòu)機(jī)制探討 SHR VSMC 原代培養(yǎng)采用貼塊法，常規(guī)方法制備調(diào)方含藥血清及正常對(duì)照血清，噻唑藍(lán)(MTT)染色法篩選適合VSMC生長(zhǎng)的調(diào)方含藥血清濃度，從鈣系統(tǒng)、PDGF—A、TGF—β<,1>角度探討調(diào)方逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)的機(jī)制。 二、結(jié)果: (一)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方發(fā)病前不

9、同時(shí)段給藥逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的整體療效學(xué)影響 本文采用SHR模型研究高血壓血管重構(gòu)的變化，揭示高血壓和血管重構(gòu)在發(fā)病前不同時(shí)段的關(guān)系，由實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出調(diào)肝腎、祛痰瘀治法及其組方于發(fā)病前和(或)發(fā)病早期實(shí)施干預(yù)，能有效地延緩SHR早期的血壓上升，在6周齡后顯示出明顯的控制血壓上升的效果；第6周時(shí)S1—4和S1—10組的血壓低于另兩組，提示“釀乳”這一間接給藥方式的效應(yīng)，其藥代動(dòng)力學(xué)有待進(jìn)一步研究。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)計(jì)量分析發(fā)現(xiàn)，S1

10、—10組對(duì)于改善VSM中膜層厚度和內(nèi)膜損傷與S空白組比較有非常顯著性差異，S1—4 對(duì)于改善VSM中膜層厚度與S空白組比較有顯著性差異，而S5—10與S空白組比較無(wú)顯著性差異。而且，VSMC 有超微結(jié)果損害，突出表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)線粒體密度不均勻，形態(tài)腫脹，嵴結(jié)構(gòu)紊亂或消失，線粒體是細(xì)胞內(nèi)的重要鈣離子庫(kù)，這種改變提示細(xì)胞內(nèi)鈣代謝失調(diào)可能是高血壓的細(xì)胞損害的重要機(jī)制。提示調(diào)方具有良好的逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的作用，早期干預(yù)(1—4周)對(duì)于血管平滑肌

11、中膜的形成、生長(zhǎng)可能有決定性意義。 (二)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方含藥血清對(duì) VSMC 內(nèi)鈣系統(tǒng)的影響 本實(shí)驗(yàn)觀察到，各組大鼠血管平滑肌鈣離子水平、鈣調(diào)素水平的變化成時(shí)段依賴性，第10周和第12 周取材的 VSMC 內(nèi)游離[ca<'2+>]i較第1周和第5周取材組明顯增高，可能與血管活性物質(zhì)和生長(zhǎng)因子可能促進(jìn)細(xì)胞膜鈣離子通道的開(kāi)放增加了細(xì)胞對(duì)鈣的攝取有關(guān)；第1周和第5 周取材組[Ca<'2+>]i與S12比較有非常顯著性差異；

12、使用含藥血清后，各中藥血清組[Ca<'2+>]i 均較正常血清組低，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但提示調(diào)方含藥血清有降低胞內(nèi)游離鈣濃度的趨勢(shì)，使VSMC增殖肥大作用明顯減弱，與實(shí)驗(yàn)三的結(jié)果相結(jié)合來(lái)看，可能與具有拮抗生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞膜鈣離子通道主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣的作用有關(guān)。各組 VSMC Ca<'2+>-ATP 活性變化成時(shí)段依賴性，即S1>S5>S10>S12，S1、S5、10中藥血清組VSMC Ca<'2+>-ATP活性與S12比較有非常顯著性差異，提示

13、Ca<'2+>-ATP活性隨高血壓的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系；使用含藥血清后，各中藥血清組VSMC Ca<'2><'+>-ATP 活性均較正常血清組高，提示調(diào)方含藥血清可上調(diào) VSMC Ca<'2+>-ATP活性，其機(jī)制可能與降低胞內(nèi)高Ca<'2+>濃度可以進(jìn)一步上調(diào)Ca<'2+>活性有關(guān)。 (三)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方對(duì)VSMC內(nèi)PDGF-A、TGF-β<,1>的影響 本研究發(fā)現(xiàn)：PDGF-A 鏈和TGF-β<,1>表達(dá)在S1

14、2，S10<,空>和S5，S1 具有顯著差異，S12＞S10<,空>＞S10<,藥>＞S5<,空>＞S5<,藥>＞S1，在S1各組中PDGF-A和TGF—β<,1>鏈幾乎無(wú)表達(dá)，S5 各組中僅有微量表達(dá)，而在S10 兩組中比較，含藥血清組的表達(dá)又少于空白組，S10<,空>與S12的表達(dá)量差異不明顯。這一結(jié)果提示：①這種自身PDGF—A鏈和TGF—β<,1>的高表達(dá)，可能在自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖肥大、血管功能異常中具有重要作用

15、。②含藥血清不同時(shí)段給藥對(duì)PDGF—A鏈和TGF—β<,1>表達(dá)的抑制作用不同，提示早期干預(yù)有重要意義。 第三部分研究結(jié)論: 一、研究顯示，調(diào)肝腎、祛痰瘀治法及其方藥在高血壓發(fā)病前不同時(shí)段給藥，有確切的延緩血壓上升的作用，而且作用效果平穩(wěn)、持久、緩和，以全程給藥組作用最佳，從而部分揭示了這一臨床組方思路的可行性與合理性。 二、調(diào)方能改善VSM中膜厚度和VSMC 超微結(jié)構(gòu)，提示調(diào)方能逆轉(zhuǎn)高血壓血管重構(gòu)現(xiàn)象，具有一定