小麥籽粒產(chǎn)量候選基因（CKX）的克隆、遺傳定位與多樣性分析.pdf

1、遺傳改良或基因工程是提高作物產(chǎn)量的有效手段之一。小麥籽粒產(chǎn)量及其構(gòu)成因素是由多個(gè)基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，相關(guān)分子遺傳調(diào)控機(jī)理還不清楚。因此，小麥籽粒產(chǎn)量候選基因的克隆及其相關(guān)研究成果不僅可以為小麥高產(chǎn)育種提供有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和重要應(yīng)用前景的新基因，同時(shí)也可以在闡明作物產(chǎn)量和種子發(fā)育的分子遺傳調(diào)控機(jī)理方面進(jìn)行有益的嘗試。本研究根據(jù)水稻、擬南芥、玉米等植物中的研究成果，將植物細(xì)胞分裂素代謝過程中的關(guān)鍵基因——細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶(CKX)作

2、為小麥籽粒產(chǎn)量的功能候選基因，通過遺傳作圖、基因多樣性研究、表達(dá)分析等途徑分析了CKX基因與小麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素間可能存在的聯(lián)系，取得的主要結(jié)果如下： 1.采用同源克隆結(jié)合BAC文庫篩選的方法從普通小麥中國春中分離得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。序列分析表明，TaCKX5基因的開放閱讀框?yàn)?596bp，編碼531個(gè)氨基酸，與水稻OsCKX5基因直向同源。含有CKX因家族典型的功能位點(diǎn)FAD-bindingdomai

3、n，預(yù)測(cè)屬于分泌蛋白，并具有糖基化位點(diǎn)。缺體一四體定位表明，TaCKX5布于小麥染色體3A、3B、3D上。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CKX因在植物中較為保守，禾谷類作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性與功能。 2.根據(jù)已知的水稻穗粒數(shù)基因OsCKX2基因序列，同源克隆得到與其直向同源的小麥TaCKX6基因，并對(duì)TaCKX6進(jìn)行了以下研究： (1)使用偃展1號(hào)/內(nèi)鄉(xiāng)188 RILs群體和旱選10號(hào)/魯麥14DH群體對(duì)Ta

4、CKX6基因進(jìn)行了遺傳作圖，作圖結(jié)果表明TaCKX6在兩個(gè)不同的分離群體中同時(shí)被定位于3D染色體的相同區(qū)域。在偃展1號(hào)/內(nèi)鄉(xiāng)188RILs群體中，TaCKX6-D1位于SSR標(biāo)記CFD70和WMC533之間，遺傳距離分別為3.7和2.0cM；在旱選10號(hào)/魯麥14DH群體中，TaCKX6-D1位于SSR標(biāo)記Xgdm72和Xgwm34之間，遺傳距離分別為6.0和2.5cM，與缺體-四體定位結(jié)果一致； (2)根據(jù)TaCKX6序列設(shè)計(jì)

5、出了等位基因特異引物，采用PCR直接測(cè)序的方法研究了TaCKX6基因在小麥野生近緣種、農(nóng)家種和現(xiàn)代育成品種中的等位基因多樣性，通過分析TaCKX6基因在三類種質(zhì)中的等位變異類型與分布頻率，認(rèn)為TaCKX6基因在從小麥野生近緣種到農(nóng)家種的馴化過程中經(jīng)歷了明顯的瓶頸效應(yīng)； (3)根據(jù)TaCKX6-D1不同等位變異類型的差異設(shè)計(jì)出了In-Del標(biāo)記，在偃展1號(hào)/內(nèi)鄉(xiāng)188RILs群體和旱選10號(hào)/魯麥14DH群體中進(jìn)行標(biāo)記一性狀的關(guān)聯(lián)

6、分析發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)不同遺傳背景的分離群體中，TaCKX6-D1第2內(nèi)含子處18bp插入/缺失的變化均與千粒重相關(guān)顯著，并且在不同年際和地點(diǎn)間表現(xiàn)穩(wěn)定；同樣，在由115份材料構(gòu)成的自然群體中仍可檢測(cè)到TaCKX-D1內(nèi)含子處的插入/缺失變化與粒重相關(guān)； (4)篩選獲得了TaCKX6-D1基因的一對(duì)近等基因系：R43/百農(nóng)3217BC7F6和百農(nóng)3217，t檢驗(yàn)表明二者在粒長和千粒重兩個(gè)性狀上差異顯著； (5)采用半定量RT-

7、PCR和Real-Time PCR方法分析了TaCKX6基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明，與TaCKX5和TaCKX2相比，TaCKX6是在小麥籽粒發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)的基因，并且在籽粒授粉后0-6天表達(dá)逐漸增強(qiáng)，此階段正是決定粒長的關(guān)鍵時(shí)期，結(jié)合在近等基因系中的鑒定結(jié)果，我們認(rèn)為小麥中的TaCKX6基因通過控制粒長影響千粒重。 3.采用同源克隆結(jié)合文庫篩選的方法，克隆獲得小麥的TaCKX2基因，并根據(jù)基因3'-UTR區(qū)的一段SSR序列設(shè)計(jì)

8、引物，開發(fā)出了目標(biāo)基因的SSR標(biāo)記：TaCKX2 SSR。序列分析表明，TaCKX2開放閱讀框長度為1554bp，編碼517個(gè)氨基酸。通過對(duì)基因的全長序列比對(duì)證明小麥TaCKX2基因與水稻OsCKX11基因直向同源(cDNA序列相似性為85.3％)，而非前人根據(jù)EST報(bào)道的與水稻OsCKX6基因直向同源。利用小麥缺體-四體系將TaCKX2定位在小麥染色體7B、7D上。利用由199個(gè)株系構(gòu)成的偃展1號(hào)/內(nèi)鄉(xiāng)188RILs作圖群體將TaCK