位于microRNA結(jié)合位點的基因多態(tài)與心腦血管疾病的相關(guān)性研究.pdf

1、心腦血管病是當(dāng)今威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一。據(jù)最新的統(tǒng)計資料顯示：在我國，心腦血管病是僅次于癌癥的第二大致死疾病。腦卒中是心腦血管疾病主要類型之一，存在著明顯三高(發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高)現(xiàn)象。引起腦卒中的原因眾多，如高齡、吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、高血糖、心臟病、凝血機(jī)制障礙等，此外許多證據(jù)表明遺傳因素在腦卒中的發(fā)病中有顯著作用。尋找腦卒中的致病基因，從分子水平揭示腦卒中的發(fā)病機(jī)理，可為及早發(fā)現(xiàn)腦卒中的危險人群、預(yù)防腦卒中的發(fā)

2、生提供幫助。 腦卒中是一種復(fù)雜疾病，發(fā)病過程涉及動脈粥樣硬化病變。在動脈粥樣硬化和動脈疾病的病理生理學(xué)過程中，血管發(fā)生是研究的熱點。血管生成素-1(Angiopoietinl，ANGPT1)是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，是酪氨酸激酶受體Tie-2的特異性配體。血管生成素-1在血管發(fā)生過程中起到了重要作用，它可以促進(jìn)血管重塑、成熟、阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，具有維持血管的完整性，促進(jìn)血管損傷修復(fù)的功能。血管生成素-1的功能提示我

3、們，任何影響其表達(dá)的基因多態(tài)性，都可能會與血管性疾病相關(guān)。通過對文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫的查詢，我們發(fā)現(xiàn)，血管生成素-1的3’-UTR區(qū)域存在SNP+1602 A/T，該位點被預(yù)測位于microRNA的結(jié)合識別區(qū)域，可能會影響microRNA與mRNA的結(jié)合。因此我們假設(shè)，+1602A/T可以影響血管生成素-1的表達(dá)，可能與腦卒中相關(guān)。 為了證明我們的假設(shè)，我們設(shè)計了熒光素酶報告系統(tǒng)實驗，通過檢測熒光素酶的表達(dá)來驗證SNP是否影響基因表達(dá)。

4、首先我們構(gòu)建了含有SNP的熒光素酶質(zhì)粒，然后與micorRNA或者對照一起共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，最后通過雙熒光素酶檢測來確定基因表達(dá)的情況。 實驗結(jié)果證實：在microRNA存在的條件下，與SNP位點為T的熒光素酶質(zhì)粒相比，SNP位點為A的熒光素酶質(zhì)粒表達(dá)下降超過50％(P<0.01)。而在對照或者空白條件下，無論攜帶哪一種SNP位點，熒光素酶的表達(dá)均不發(fā)生改變。這說明microRNA可以通過識別不同的SNP對表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

5、在驗證了SNP的功能以后，我們進(jìn)一步采用病例對照的研究方法，以兩個獨立的中國漢族樣本為研究對象，探討了血管生成素-1的SNP+1602 A/T在腦卒中患者各個亞型和正常對照中的分布，檢測SNP是否與腦卒中相關(guān)。基因型鑒定采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)?；蛐皖l率的分布符合Hardy-Weinberg平衡。 在第一個研究人群中，共計有腦?；颊?03例，腔?；颊?99例，出血性腦卒中患者489例，正常對照1843

6、例進(jìn)行了基因分型，各組間年齡、性別相匹配。結(jié)果顯示：在正常對照中該基因分布為AA型31.9％、AT型48.5％、TT型19.6％；等位基因A和T的頻率分別為0.561和0.439。在腦?；颊呓M中該基因分布為AA型34.9％、AT型46.9％、TT型18.2％；等位基因A和T的頻率分別為0.583和0.417。與對照組相比，腦?；颊呓M中三種基因型分布沒有顯著性差異。在腔?；颊呓M中該基因分布為AA型39.5％、AT型48.3％、TT型12.

7、2％；等位基因A和T的頻率分別為0.636和0.364。與對照組相比，腔?；颊呓M中AA型和TT型分布存在顯著性差異(P<0.01)。在出血性腦卒中組中該基因分布為AA型41.1％、AT型49.1％、TT型9.8％；等位基因A和T的分布頻率分別為0.656和0.344。與對照組相比，出血性腦卒中組中AA型和TT型分布存在顯著性差異(P<0.01)。Logistic回歸分析結(jié)果證明：在校正了傳統(tǒng)危險因素以后，血管生成素-1的+1602 AA

8、基因型是引起出血性腦卒中的獨立危險因素(P<0.01)。 在第二個研究人群中，共計有缺血性腦卒中患者238例，出血性腦卒中患者157例，正常對照790例進(jìn)行了基因分型，各組間年齡、性別相匹配。結(jié)果顯示：在正常對照中該基因分布為AA型32.9％、AT型47.8％、TT型19.3％；等位基因A和T的頻率分別為0.568和0.432。在缺血性腦卒中組中該基因分布為AA型40.8％、AT型48.7％、TT型10.5‰等位基因A和T的頻率

9、分別為0.595和0.405。與對照組相比，AA型和TT型分布存在顯著性差異(P<0.01)。在出血性腦卒中組中該基因分布為AA型43.3％、AT型47.1％、TT型9.6％；等位基因A和T的頻率分別為0.669和0.331。與對照組相比，AA型和TT型分布存在顯著性差異(P<0.01)。Logistic回歸分析結(jié)果證明：在校正了傳統(tǒng)危險因素以后，血管生成素-1的+1602AA基因型是引起缺血性腦卒中的獨立危險因素(P=0.047)；同

10、時血管生成素-1的+1602 AA基因型也是引起出血性腦卒中的獨立危險因素(P<0.01)。 通過分析兩個獨立樣本的研究結(jié)果，確認(rèn)血管生成素-1的+1602 AA基因型可以增加出血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險，但對于缺血性腦卒中的發(fā)病影響尚存在不同的結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。 本研究選擇血管生成素-l的SNP+1602 A/T作為研究對象，研究SNP的功能以及與腦卒中的相關(guān)性。結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)SNP+1602 A/T可以通過影響micro