Endostatin、bFGF、CD34在膽囊癌中表達(dá)及意義的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測膽囊癌手術(shù)標(biāo)本石蠟切片中。Endostatin、bFGF及CD34的表達(dá)情況，目的在于探討它們與膽囊癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解膽囊癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，尋求膽囊癌早期診斷及治療的新途徑。 研究實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)材料： 收集61例膽囊癌手術(shù)后的石蠟包埋膽囊標(biāo)本，另取10例正常膽囊組織標(biāo)本進(jìn)行對照。 2、實(shí)驗(yàn)試劑： 兔抗人Endostatin多克隆抗體(濃縮型)(

2、Neomarkers，美國)，兔抗人bFGF多克隆抗體(濃縮型)(Santa，美國)，鼠抗人CD34單克隆抗體(即用型)、S-P試劑盒(包括：A．過氧化物酶阻斷劑B．正常動物非免疫血清C．生物素標(biāo)記的第二抗體D．鏈霉素抗生物素蛋白．過氧化物酶溶液F．DAB kit顯色劑)和陽性切片(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。 3、主要實(shí)驗(yàn)儀器：(1)螢光倒置顯微鏡(Olympus ix 51，日本)(2) 顯微圖像采集CCD(Olympu

3、s DP 71，日本) 實(shí)驗(yàn)方法： 1、免疫組化 采用我院病理科常規(guī)S-P免疫組化染色方法。3μm厚石蠟切片，脫臘，至水，高溫抗原修復(fù)，0.3％過氧化氫甲醇液，阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，5％正常非免疫動物血清封閉內(nèi)源性抗原，滴加一抗和二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明后中性樹膠封片。以PBS代替一抗設(shè)陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。Endostatin及bFGF蛋白陽性表達(dá)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)采用的方法：隨機(jī)選擇10

4、個高倍視野共記錄1000個膽囊癌細(xì)胞，并計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞百分比，結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，以兩者乘積為最后得分：0～3分為陰性(-)，3～6分為弱陽性(+)，6～9分為陽性(++)，大于9分為強(qiáng)陽性(+++)。微血管密度判斷：采用CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)單位面積中的微血管數(shù)目，即微血管密度(MVD)，由此來衡量腫瘤血管生成的活躍程度。參照Weidner法先在低倍鏡下選取腫瘤微血管數(shù)量最豐富的區(qū)域，然后在200倍視野范圍計(jì)算4個視野

5、血管的數(shù)目，取其平均值作為MVD。凡染色呈棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個血管計(jì)數(shù)，而不以紅細(xì)胞的出現(xiàn)來確定是否是血管，也不以是否出現(xiàn)管腔來計(jì)數(shù)血管。凡管腔大于8個紅細(xì)胞大小或管壁有平滑肌組織者不作為微血管計(jì)數(shù)。 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料采用X<'2>檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，方差分析及Q檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS10.0軟件。 研究結(jié)果： 1、Endostatin的表達(dá)Endost

6、atin在正常膽囊組織，膽囊癌中的陽性表達(dá)率分別為40％、77.05％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.05)，61例膽囊癌中，Endostatin表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P<0.05)，臨床中晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)增強(qiáng)，與性別、年齡、腫瘤部位、大小及組織學(xué)分級無關(guān)。 2、bFGF的表達(dá)bFGF在正常膽囊組織，膽囊癌中的陽性表達(dá)率分別為20％、67.21％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.05)，61例膽囊癌中，bFG

7、F表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P<0.05)，臨床中晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)增強(qiáng)，與性別、年齡、腫瘤部位、大小及組織學(xué)分級無關(guān)。 3、CD34的表達(dá)： 通過CD34表達(dá)計(jì)算微血管密度MVD，膽囊癌中MVD均值76.66±20.15，明顯高于正常膽囊組織(29.53±5.03)(P<0.01)，61例膽囊癌中，Nevin分期Ⅲ～Ⅴ期MVD均值80.53±17.98，顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(46.79±5.38)(P<

8、0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MVD均值94.60±7.28，顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(58.12±9.24)(P<0.01)，組織學(xué)分級G1組60.59±14.71、G2組83.08±15.30、G3組96.53±6.92，組間差異明顯(P<0.01)，與性別、年齡、腫瘤部位及大小無關(guān)。 4、膽囊癌組織中。Endostatin、bFGF的表達(dá)與MVD的關(guān)系： Endostain的表達(dá)與MVD關(guān)系密切(P<0.01)，bF

9、G-F的表達(dá)與MVD關(guān)系密切(P<0.01)，Endostatin與bFGF的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P>0.05)。 研究討論： 在正常組織中，促血管形成因子與抗血管形成因子均衡時，血管處于靜止?fàn)顟B(tài)，稱為休眠。腫瘤發(fā)生后，促血管形成因子增多而抗血管形成因子相應(yīng)減少，導(dǎo)致血管增生，從而使腫瘤組織得以增生并發(fā)生轉(zhuǎn)移。促血管形成因子bFGF和抗血管形成因子Endostatin在膽囊癌中的表達(dá)及相互作用情況如何，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。

10、本研究運(yùn)用免疫組化方法檢測Endostatin和bFGF在膽囊癌中的表達(dá)，并以MVD(通過CD34表達(dá)表示)作為血管生成的客觀定量指標(biāo)，以期尋找二者與血管生成的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明Endostatin表達(dá)與MVD、bFGF表達(dá)與MVD關(guān)系密切，二者在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用是顯而易見的。 研究結(jié)論： 1、Endostain及bFGF表達(dá)、MVD在膽囊癌中均顯著高于正常膽囊組織，在膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展中起一定的作用。

11、2、Endostain在膽囊癌中隨著臨床分期級別的增高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)明顯增強(qiáng)，Endostain高表達(dá)者惡性程度高，浸潤性強(qiáng)。 3、bFGF在膽囊癌中隨著臨床分期級別的增高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)明顯增強(qiáng)，bFGF高表達(dá)者惡性程度高，浸潤性強(qiáng)。 4、MVD在膽囊癌中隨著臨床分期級別的增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級的增高而明顯增多，MVD高者腫瘤新生血管豐富，惡性程度高。 5、Endostain的表達(dá)與MVD關(guān)系密切，bF