PEG交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能研究.pdf

1、第一部分:PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料構建及其體外生物相容性
　　 目的：PEG 交聯(lián)去細胞瓣構建復合材料，并評價其體外生物相容性。
　　 方法：（1）合成功能團為丙烯酰基的枝化狀PEG，同時在去細胞瓣上引入巰基，通過丙烯酰基與巰基發(fā)生邁克爾加成反應，構建PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料。（2）生物力學測試評價PEG 交聯(lián)對去細胞瓣機械性能的影響； CCK-8 法檢測復合材料浸提液對人臍靜脈內皮細胞增殖率影響，以評價其生物相

2、容性。
　　 結果：復合材料構建條件溫和、效果確切；復合材料抗拉強度明顯高于去細胞瓣，且與天然瓣膜抗拉強度相比，差異無統(tǒng)計學差異。復合材料與去細胞瓣毒性評級均為0 級，與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；人臍靜脈內皮細胞在含復合材料浸提液的培養(yǎng)液中形態(tài)良好，增殖旺盛。
　　 結論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣的方法能夠構建與天然瓣膜相似抗拉強度且無細胞毒性的復合材料。
　　 第二部分：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料構

3、建
　　 第一節(jié)：構建RGD-復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料結合粘附肽（精-甘-天冬氨酸RGD 肽）的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 不同濃度（1.5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml）GRGDSPC肽溶液在37℃反應，在不同時間點（1h，2h，4h），用分光光度法檢測復合材料結合GRGDSPC 肽質量，并行免疫熒光定性檢測，去細胞瓣作為陰性對照

4、。
　　 結果：GRGDSPC 肽能有效地結合于復合材料，且一片復合材料與1ml GRGDSPC 肽（1mg/ml）在37℃條件下反應2h，結合GRGDSPC 肽質量最大為（0.79±0.01）mg。
　　 結論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結合RGD 肽，構建RGD-復合材料。
　　 第二節(jié)：構建VEGF-復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料結合血管內皮細胞生長因子（

5、VEGF）的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 不同濃度（500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml）VEGF 溶液在37℃反應，在不同時間點（1h，2h，4h，12h），用ELISA 法檢測復合材料結合VEGF 質量，并行免疫熒光檢測，去細胞瓣作為陰性對照。
　　 結果：VEGF 能有效地結合于復合材料，且一片復合材料與1ml VEGF（1000pg/ml）在37℃反應4h，其結合VEGF 質

6、量最大為（896.87±3.27）pg。
　　 結論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結合VEGF，構建VEGF-復合材料。
　　 第三節(jié)：構建PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料同時結合RGD 肽和VEGF的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 反應液（包含1mg/mlGRGDSPC 肽和1000pg/mlVEGF）在37℃
　　

7、 反應4h，對反應后復合材料行免疫熒光檢測，去細胞瓣作為陰性對照。
　　 結果：GRGDSPC 肽和VEGF 能同時有效地結合于復合材料。
　　 結論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結合RGD 肽和VEGF，構建PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料。
　　 第三部分：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能研究
　　 第一節(jié)：內皮祖細胞分離、培養(yǎng)與鑒定目的：分離、培

8、養(yǎng)、鑒定臍帶血內皮祖細胞，為其作為組織工程種子細胞提供實驗依據(jù)。
　　 方法：密度梯度離心法分離新鮮臍血中單個核細胞，在含堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過形態(tài)學、免疫熒光和流式細胞儀等對貼壁細胞進行鑒定；并與臍靜脈內皮細胞進行增殖和遷移能力比較。
　　 結果：隨培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，從小圓變成梭形，逐漸形成特征性克隆和典型成熟內皮細胞鵝卵石樣形態(tài)；體外培養(yǎng)7天后，90％以上貼壁

9、細胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I 雙染陽性；貼壁細胞流式細胞儀分析顯示：培養(yǎng)7 d的細胞VEGFR-2、CD34和CD133表達分別占(77.35±4.86)％、(52.42±6.64)％和(19.36±2.14)％，培養(yǎng)28天的細胞VEGFR-2和CD34表達分別占(81.06±7.31)％和(7.62±3.14)％，而未檢測到CD133表達；人內皮祖細胞增殖和遷移能力明顯高于人臍靜脈內皮細胞。
　　 結論：用

10、密度梯度離心法和貼壁篩選法，可成功分離出臍帶血內皮祖細胞，該方法簡單、經濟、可行；且內皮祖細胞可向內皮細胞分化，增殖和遷移能力強，有望成為理想種子細胞。
　　 第二節(jié)：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能測定
　　 目的：研究PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料對內皮祖細胞粘附和增殖的影響，為進一步構建TEHV 提供依據(jù)。
　　 方法：A組去細胞瓣，B組PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，C組

11、VEGF-復合材料，D組為RGD-復合材料，E組PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料。然后在各組材料上種植EPCs，分別在種植后2h、4h、8h 用細胞計數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測各組材料上細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映EPCs在各組材料上粘附性；分別在種植后2d、4d、8d，用細胞計數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測各組瓣膜支架上細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映各組材料上EPCs 增殖情況。在種植8d 時，取各組瓣膜支架行蘇木素-

12、伊紅染色和掃描電鏡，以檢測EPCs在各組材料上生長情況，并取E組支架材料上細胞行RT-PCR檢測t-PA和eNOS的表達，以評價新內皮抗血栓形成功能。
　　 結果：（1）種植后2h、4h、8h 時各組細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：D組＞E組＞C組＞A組＞B組，其中A組與B組之間各個時間點均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）,8h時D組與E組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余時間點各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）

13、種植2d、4d、8d 時各組細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：A組均大于B組（P＞0.05），C組、D組和E組均大于同一時間點A組和B組（P＜0.05）；種植2d 時，E組＞C組（P＜0.05），D組＞E組（P＞0.05）；種植4d 時，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＜0.05）；種植8d 時，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＞0.05）。（3）蘇木素-伊紅染色和掃描電鏡檢測顯示：種植8d后，與其它組相比，E組瓣膜支架上可見