異源精子人工誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體的細(xì)胞學(xué)研究.pdf

1、本文采用遺傳失活的太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)精子誘導(dǎo)櫛孔扇貝(Chlamys fareri)雌核發(fā)育二倍體。采用熒光顯微觀察、組織切片技術(shù)、染色體滴片技術(shù)、壓片技術(shù)和基因組熒光原位雜交(GISH)技術(shù)等手段，對櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究，并對紫外線失活精子和染色體加倍的適宜參數(shù)進(jìn)行篩選。主要研究內(nèi)容分為以下三部分： 一、櫛孔扇貝♀×太平洋牡蠣♂受精和早期胚胎發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)觀察 采用熒

2、光顯微觀察和組織切片技術(shù)，對櫛孔扇貝♀×太平洋牡蠣♂受精和第一、二次卵裂過程中核相變化進(jìn)行觀察與分析，運用壓片法和熱滴片法分別對4-8細(xì)胞期胚胎和擔(dān)輪幼蟲進(jìn)行染色體制片，并對染色體數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果表明，熒光顯微觀察與組織切片觀察結(jié)果相同，太平洋牡蠣精子可以進(jìn)入櫛孔扇貝卵子，并激活卵子使其釋放第一極體(PB1)和第二極體(PB2)；雌、雄原核形成后融合為合子核；受精卵開始第一次卵裂；雜交胚胎發(fā)育過程中，囊胚期延長、胚胎畸形嚴(yán)重，

3、擔(dān)輪幼蟲期出現(xiàn)大量死亡，未檢測到成活的D形幼蟲；雜交胚胎染色體數(shù)目變化范圍較大，在20-85之間，受精過程中存在多精入卵及染色體多極分離現(xiàn)象。 二、異精櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)參數(shù)的篩選 1.太平洋牡蠣精子遺傳失活 太平洋牡蠣精子經(jīng)照射強度為1500μw/cm<'2>的紫外線遺傳失活，與櫛孔扇貝卵子受精，照射時間從0s到120s間隔10s設(shè)置梯度，誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育單倍體，設(shè)太平洋牡蠣卵子為對照組；通過滴片法

4、和壓片法制備染色體以檢測單倍體率；統(tǒng)計受精率和早期胚胎存活率以確定最佳照射時間。結(jié)果表明，1500μw/cm<'2>的紫外線照射太平洋牡蠣60s是獲得櫛孔扇貝雌核發(fā)育單倍體的適宜條件。隨著照射時間的增加，受精率明顯下降，早期胚胎存活率存在"Hertwig"效應(yīng)。 2.藥物處理使染色體加倍 太平洋牡蠣精子失活后與櫛孔扇貝卵子受精，受精后11.5h用濃度為60mg/L的6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)抑制第二極體的排出，6

5、-DMAP對櫛孔扇貝受精卵分別持續(xù)處理15min、20min、25min和30min，運用熱滴片法對各實驗組進(jìn)行倍性檢測。結(jié)果表明，最佳藥物持續(xù)處理時間為20min，其二倍體率為24.1％；異源誘導(dǎo)櫛孔扇貝單倍體組和二倍體組中胚胎均可以發(fā)育到D形幼蟲期，其單倍體組中的D形幼蟲率為5.0％，20min藥物加倍二倍體組D形幼蟲率為6.1％。三、異精誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體受精過程的細(xì)胞學(xué)觀察及雌核二倍體的檢測 采用熒光顯微觀察和組織切片

6、技術(shù)，對用紫外線失活的太平洋牡蠣精子誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體在受精和第一、第二次卵裂過程中的核相變化進(jìn)行了詳細(xì)觀察；用基因組原位雜交(GISH)技術(shù)，對雌核發(fā)育子代進(jìn)行倍性鑒定。結(jié)果顯示，精子經(jīng)紫外線照射入卵后其精核一直處于凝縮狀態(tài)，不能形成雄原核，不與雌原核融合，在第一次卵裂中期，精核并不像雌原核一樣形成染色體，而是形成一致密的染色質(zhì)小體(DCB)，不參與核分裂，位于兩組分開的母本染色體之間，到第一次卵裂結(jié)束時DCB滯留于兩卵裂球的