強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)節(jié)滑膜高表達(dá)碳酸酐酶1.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)發(fā)病機(jī)理目前尚未明確，眾多學(xué)者認(rèn)為其是慢性炎癥性疾病，為自身免疫系統(tǒng)發(fā)生不當(dāng)應(yīng)當(dāng)誘發(fā)自身組織損害，該病的發(fā)病目前可以明確與遺傳、環(huán)境等多因素有關(guān)聯(lián)。人類白細(xì)胞抗原B27目前被認(rèn)為可能在強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用；隨著研究的深入而廣泛開展，近幾年大量研究發(fā)現(xiàn)參與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病的基因還包括：其他主要組織相容性復(fù)合體(MHC)類基因以及一些非MHC基因；從發(fā)病

2、的環(huán)境方便，學(xué)者們則主要是認(rèn)為某些微生物感染可能參與了AS的發(fā)病，脊柱關(guān)節(jié)病等感染與免疫關(guān)聯(lián)的疾病之間存在關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)，感染在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)制中作為環(huán)境因素的地位也越來越受到學(xué)術(shù)界的重視；該病是以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的全身性自身免疫性疾病，可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，一般是髖關(guān)節(jié)最易受到侵犯，其他膝、踝關(guān)節(jié)侵犯臨床少見，肌腱、韌帶附著點(diǎn)炎性改變是強(qiáng)直性脊柱炎患者外周關(guān)節(jié)的特征性病理變化；嚴(yán)重者病情發(fā)展迅速嚴(yán)重者可導(dǎo)致脊柱及關(guān)節(jié)的強(qiáng)直，

3、從而導(dǎo)致患者脊柱及關(guān)節(jié)功能受到嚴(yán)重?fù)p害，影響正常生理活動(dòng)。
　　 強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種具高度遺傳性的疾病，這一點(diǎn)已經(jīng)為學(xué)術(shù)界所公認(rèn)，從臨床發(fā)病看，遺傳特征亦是非常明顯；國內(nèi)外的學(xué)者多年來對強(qiáng)直性脊柱炎的家族發(fā)病的調(diào)查研究也充分證實(shí)了該病的遺傳特性，另外強(qiáng)直性脊柱炎孿生兄妹，特別是單卵雙胎或多胎者，發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎者明顯帶有基因遺傳特征；人類白細(xì)胞組織抗原HLAB-27抗原參與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制，而且在其整個(gè)病理生理機(jī)制

4、中可能起到核心的關(guān)鍵作用，諸多的研究結(jié)果佐證這一點(diǎn)，也為學(xué)界所不容置疑來；HLAB27轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，而且該動(dòng)物模型有類似強(qiáng)直性脊柱炎的病變發(fā)生，更使學(xué)者們肯定了HLAB27與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病息息相關(guān)；有研究表明與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)制強(qiáng)相關(guān)的是B-27各亞型共有序列特征(即B-27特異性抗原決定基)；人類白細(xì)胞抗原B-27亞型分布頻率在不同人種分布頻率有明顯差異，這一點(diǎn)也被世界各地學(xué)者在大量不同種族的患者中調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)而證實(shí)，但

5、無論哪種人群，一旦罹患強(qiáng)直性脊柱炎，其臨床表現(xiàn)卻無多大差異，所以學(xué)者們認(rèn)為B-27的特異性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病，而并非人類白細(xì)胞抗原各亞型特異基團(tuán)。目在強(qiáng)直性脊柱炎患者檢測到B-2701、B-2702、B-2703、B-2704、B-2705和B-2710亞型，其中自種人強(qiáng)直性脊柱炎患者與B-2705、B-2702有關(guān)。HLA B27亦可存在于正常人體內(nèi)，是人體內(nèi)額外的抗原遞呈分子，其主要作用是與β2微球蛋白形成復(fù)合物，選擇性結(jié)

6、合相應(yīng)的抗原肽，將其遞呈至細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞表面受體，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型HLA蛋白可被自然殺傷細(xì)胞上的殺傷免疫球蛋白受體識(shí)別，但是該機(jī)制是否參與AS的致病尚不清楚。近些年來除掉HLAB27，眾多學(xué)者將目光聚焦到許多非B27MHC基因；HLA B60首先被實(shí)驗(yàn)證實(shí)在B27陽性的AS患者中出現(xiàn)率高于正常人群，另外在B27陰性的患者中陽性率也顯著要高的多；帶HLA60的人群中，臨床資料研究結(jié)果證實(shí)導(dǎo)致罹患強(qiáng)直性脊柱炎的

7、概率要較正常人高3～6倍；其他基因諸如許多HLA B等位基因也受到學(xué)界關(guān)注，有人提出HLA B與B27陰性的AS發(fā)病相關(guān)，明確的如B7與B27陰性的美國非裔AS患病相關(guān)，B16、B35以及B62與B27陰性的高加索AS患病相關(guān)，B38、B39與日本B27陰性的AS患者發(fā)病相關(guān)，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70與墨西哥AS發(fā)病相關(guān)。這些基因的提出雖然尚未得到確認(rèn)，但也為AS的致病機(jī)制的探索提供了更為廣闊的探索

8、空間。還有很多學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)向免疫學(xué)異常方面，提出錯(cuò)誤折疊學(xué)說、表面同型二聚體學(xué)說等假說，認(rèn)為細(xì)胞表面表達(dá)自由重鏈，形成重鏈二聚體，增加了重鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致了應(yīng)激反應(yīng)，錯(cuò)誤折疊產(chǎn)生的HLA B27分子在細(xì)胞表面的肽被自身免疫細(xì)胞識(shí)別，CD4+T細(xì)胞反應(yīng)則相應(yīng)地受到激活；這些CD4+T細(xì)胞可以與HLA B27的異常形式反應(yīng)，尤其是B27重鏈二聚體可以模擬MHCⅡ類分子而被CD4+T細(xì)胞識(shí)別引發(fā)自身免疫反應(yīng).此外，自由的重鏈二聚

9、體還能被Ig樣受體結(jié)合，暴露于天然免疫細(xì)胞表面，干擾正常的HLAⅠ型介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。但是歐洲學(xué)者Tran等對HLA B27轉(zhuǎn)基因大鼠的研究結(jié)果卻步支持這個(gè)理論，目前大多數(shù)學(xué)者比較支持分子模擬學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為外源肽如某些微生物與HLAB27的致病亞型的某些成分相似，外源肽進(jìn)入機(jī)體后，通過分子模擬引發(fā)機(jī)體對自身抗原成分(即HLA B27)發(fā)生異常免疫反應(yīng)，即自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。耶爾森菌、沙門菌、志賀菌、克雷伯菌均有成分與HLA

10、 B27分子α1螺旋可變區(qū)的第70～78氨基酸序列相同，提示腸道桿菌可能通過分子模擬機(jī)制參與AS的致病，符合衣原體與人類HSP約有75％的氨基酸序列相似，自身的HSP60與機(jī)體對衣原體HSP60產(chǎn)生的抗體IgA有交叉反應(yīng)；此外，對衣原體基因組的篩查發(fā)現(xiàn)衣原體DNA引物酶(211～222)與HLA B27配體(309～320)存在相似片段，該片段在體外與B27分子結(jié)合的能力與B2702、B2704、B2705相類同。故推測，持續(xù)存在于機(jī)體

11、內(nèi)的衣原體的某些片段作為內(nèi)源性肽可模擬機(jī)體自身的HLA B27配體，被HLA B27分子遞呈，從而引發(fā)機(jī)體的自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致了AS的發(fā)生。已證實(shí)衣原體產(chǎn)生的內(nèi)源性片段在活體內(nèi)也可被人細(xì)胞上的HLA B27遞呈。此外，沙眼衣原體610編碼的基因產(chǎn)物也可被B2705細(xì)胞遞呈，且沙眼衣原體某些基因序列與人體內(nèi)的某些蛋白所含的序列相似，這些序列還包括了HLA B27結(jié)合基序。這些研究結(jié)果均支持衣原體可能通過分子模擬的機(jī)制參與HLA B27相關(guān)

12、疾病的發(fā)生，但是其與AS的關(guān)聯(lián)尚需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。
　　 反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(reactivearthritis，ReA)與強(qiáng)直性脊柱炎同屬于血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，臨床跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎最終發(fā)展為強(qiáng)直性脊柱炎；細(xì)菌感染誘發(fā)ReA已經(jīng)得到大量研究的證實(shí)，然而微生物感染在AS中的地位仍在探索中。Mart姬nez等對墨西哥AS患者研究發(fā)現(xiàn)，AS患者臨床感染率達(dá)50％，其中腸道和上呼吸道感染率占82％，表明感染在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病中起著非

13、常重要的作用；前被提出的與AS發(fā)病可能相關(guān)的主要有肺炎克雷伯菌、沙門菌等腸道G-菌和衣原體等。早期對于肺炎克雷伯菌與AS的研究很多，學(xué)者們對AS患者糞便、血清等進(jìn)行了多種檢測，由于檢測方法、研究對象等不同，得出的結(jié)論存在爭議；斯通等對強(qiáng)直性脊柱炎家族成員的研究后結(jié)果顯示：用Kp感染AS患者與正常人外周血淋巴細(xì)胞，家族中發(fā)病成員與未發(fā)病成員均可出現(xiàn)免疫反應(yīng)。無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，在AS家族中患病成員與未發(fā)病者、以及正常對照者外周血Kp抗體陽

14、性率均無明顯差別；故Kp在AS發(fā)病中的作用有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)，腸道寄生G-菌(如沙門菌、耶爾森菌、變形桿菌等)也被提出可能參與了AS的發(fā)病。至今為止，對患者外周血、關(guān)節(jié)滑膜、滑液以及糞便培養(yǎng)均未發(fā)現(xiàn)某一特定的細(xì)菌與AS存在確實(shí)的關(guān)聯(lián)；衣原體導(dǎo)致ReA的發(fā)病已得到臨床資料及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，Carter等運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)未分化脊柱關(guān)節(jié)病(undifferentiatedspondyloarthropathy，uSpA)患者滑膜組織

15、中衣原體DNA陽性率高達(dá)62％，也為衣原體參與了uSpA的發(fā)病提供了直接有力的證據(jù)。uSpA與AS同屬于血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，且此次實(shí)驗(yàn)研究的uSpA患者中，88％存在單側(cè)影像學(xué)表現(xiàn)為2～3級(jí)的骶髂關(guān)節(jié)炎，有炎性背痛，而單側(cè)3級(jí)以上的骶髂關(guān)節(jié)炎加上背痛強(qiáng)直性脊柱炎的診斷就可成立。故此次研究結(jié)果間接提示衣原體感染與AS發(fā)病之間可能也存在關(guān)聯(lián)。關(guān)于衣原體與AS的研究較少，早期主要定位于沙眼衣原體，但未能明確其關(guān)聯(lián)，尚待于進(jìn)一步研究。強(qiáng)直性脊柱

16、炎的發(fā)病機(jī)理目前學(xué)術(shù)界尚未明晰，但普片認(rèn)為其在遺傳、炎癥或感染等多種因素共同作用，從而誘發(fā)自身免疫，導(dǎo)致組織損害的疾病；目前的研究顯示HLA B27與AS發(fā)病存在著密切的聯(lián)系，眾多非B27MHC基因及非MHC基因的提出為AS致病機(jī)制的探索提供了廣泛的思路。環(huán)境因素方面，衣原體以及其他微生物與脊柱關(guān)節(jié)病的關(guān)系的提出也為AS的發(fā)病研究提供了新的線索。然而，明確參與AS發(fā)病的微生物，進(jìn)而研究其參與致病的機(jī)制有待于更多更深入的研究。相信通過綜合

17、分析遺傳、環(huán)境等多因素的相互作用AS發(fā)病機(jī)制在不久的將來將被揭開，病因?qū)W研究的突破為AS的診斷、治療以及預(yù)防會(huì)帶來全面的革新。
　　 本課題研究框架如下：新骨形的過度生成以及骨吸收能力的增強(qiáng)是強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的重要病理特征。諸多證據(jù)表明AS病人滑膜的病理變化與該病的病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)，本研究用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較AS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，骨關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜組織的蛋白表達(dá)譜，篩選AS疾病相關(guān)的特異性表達(dá)蛋白。方法AS滑膜

18、取自髖關(guān)節(jié)，RA和OA滑膜取自膝關(guān)節(jié)。提取每個(gè)滑膜(每種疾病n=10)的總蛋白，然后按等比例濃度混合分別制備每種疾病的樣本池。用雙向凝膠電泳分析AS、RA、OA滑膜的蛋白表達(dá)譜，用質(zhì)譜分析方法鑒定AS中特異高表達(dá)的蛋白。用免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法逐一分析靶蛋白在每個(gè)滑膜中的表。結(jié)果與RA和OA相比，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶1(carbonic anhydraso I，CA1)在AS滑膜中特異性高表達(dá)。免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡均證

19、實(shí)CA1在AS滑膜中明顯表達(dá)(p=0.01)。結(jié)論本研究結(jié)果表明，CA1在強(qiáng)直性脊柱炎的滑膜組織表達(dá)量明顯高于在RA、OA中的表達(dá)量，Westernblotting和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)；通過ELISA實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了，強(qiáng)直性脊柱炎滑膜液中的CA1的表達(dá)水平明顯高于在RA、OA滑膜液中表達(dá)量的70％以上；推測AS滑膜液中的CA1有可能是AS滑膜分泌而來，以上結(jié)果充分表明CA1在AS中具有特異性高表達(dá)。CA1能促進(jìn)二氧化碳與水結(jié)合成碳酸氫

20、鹽。Parissa等實(shí)驗(yàn)CA1參與二氧化碳的水化作用的效果和碳酸鈣形成過程。他們在Tris緩沖液中加入氯化鈣和CA1進(jìn)行混勻，然后加入二氧化碳，隨著CA1濃度和溫度的升高，發(fā)現(xiàn)CA1促進(jìn)碳酸鈣沉淀的形成。Samana等，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從費(fèi)氏檸檬酸中純化出的碳酸酐酶能促進(jìn)二氧化碳和氯化鈣的反應(yīng)生成碳酸鈣沉淀。然后加入EDTA和碳酸酐酶阻斷劑乙酰唑胺后發(fā)現(xiàn)碳酸鈣急劇下降。這個(gè)結(jié)果說明CA1不但可以促進(jìn)二氧化碳的水化反應(yīng)，而且還促進(jìn)碳酸鈣沉淀形成。

21、因此，CA1在AS滑膜中過度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致病變組織的鈣化。AS的病理表現(xiàn)之一是在慢性炎癥部位有病理性新骨形成，骨的主要組成部分是磷酸鈣和碳酸鈣；在骨的形成過程中，成骨細(xì)胞分泌一種基質(zhì)叫骨樣，它是由膠原蛋白和粘多糖構(gòu)成的一種膠狀物，骨樣會(huì)使無機(jī)鹽形成一種堅(jiān)硬結(jié)晶叫礦化骨。在生理環(huán)境下，一般會(huì)抑制鈣鹽晶體的形成以保持平衡。因此，CA1在AS滑膜的過度表達(dá)可能會(huì)加速鈣鹽的沉淀而產(chǎn)生病變的礦化。乙酰唑胺是碳酸酐酶1阻斷劑，該藥物用于眼炎的治療效

22、果顯著；諸多研究可以發(fā)現(xiàn)患眼炎的病人常常會(huì)伴有強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病，大約一半的此類患者HLA-B27檢測為陽性，所以可以大膽推測AS患者滑膜組織中CA1的高表達(dá)可能解釋了這兩種疾病發(fā)病的關(guān)聯(lián)特性，另一個(gè)證據(jù)是碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺和甲醋唑胺都可以用于治療強(qiáng)直性脊柱炎，而且效果良好。CA參與鈣化和礦化的生理和病理活動(dòng)。二維電泳分析CA在大鼠牙釉質(zhì)的發(fā)育過程中，可以引起礦化而形成晶體核。禽類的蛋殼是由有機(jī)基質(zhì)和碳酸鈣結(jié)晶構(gòu)成，CA可以刺激蛋殼

23、的結(jié)晶生長，從而導(dǎo)致融合的結(jié)晶聚集。在蛋殼形成的過程中，我們可以利用乙酰唑胺來抑制鈣離子的沉積；研究發(fā)現(xiàn)CA也參與到無脊柱動(dòng)物的內(nèi)骨骼的形成。在生物礦化作用中，從軟體動(dòng)物分離出來的α-CA起著很重要的作用。α-CA的分泌物具有催化功能，它可以促進(jìn)珊瑚礁鈣化。珊瑚蟲體內(nèi)的碳酸酐酶可以使海水鈣與碳酸鹽反應(yīng)生成碳酸鈣。實(shí)驗(yàn)證明，珍珠貝殼純化可以得到新的碳酸酐酶，在生物礦化作用下，珍珠的形成呈上調(diào)。這些研究也同時(shí)說明了CA1在AS患者滑膜骨化過

24、程中的高表達(dá)會(huì)促使鈣化。
　　 本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)的辦法發(fā)現(xiàn)在AS的滑膜中，α-1-抗胰蛋白酶也是高表達(dá)，α-1-抗胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶的抑制劑；有報(bào)道也證明α-1-抗胰蛋白酶參與AS的病理途徑，在AS的免疫血清中發(fā)現(xiàn)α-1-抗胰蛋白酶的免疫球蛋白高表達(dá)，與AS的臨床指標(biāo)及其相關(guān)。α-1-抗胰蛋白酶在AS滑膜中表達(dá)同時(shí)驗(yàn)證了我們實(shí)驗(yàn)方案的可行性和真實(shí)性?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)CA1在AS滑膜組織和滑膜液中的高表達(dá)，另外也證明了CA