大鼠腦基底動脈舒張作用的EDHF機(jī)制及杜鵑花總黃酮的作用.pdf

1、內(nèi)皮依賴性超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)是除NO和PGI2外血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的第三種舒張血管的物質(zhì)。目前,在多種屬、多部位的血管中都發(fā)現(xiàn)存在EDHF反應(yīng),但血管中,尤其是在腦血管中,EDHF到底是哪種物質(zhì)還不清楚。
　　杜鵑花總黃酮(total flavones of Rhododendra,TFR)是從植物杜鵑花中提取的有效部位,本實(shí)驗(yàn)室曾發(fā)現(xiàn)TF

2、R的抗心腦血管損傷的作用,本實(shí)驗(yàn)擬對其抗心腦血管損傷作用的部分機(jī)制進(jìn)行探討。
　　目的:
　　1.探討大鼠基底動脈的EDHF反應(yīng);
　　2.研究在大鼠基底動脈中,H2S是否具有EDHF樣作用;
　　3.TFR對大鼠基底動脈的擴(kuò)張作用及其EDHF機(jī)制研究;
　　4.TFR抗心肌缺血損傷時對iNOS表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.采用離體微血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn),檢測ACh對基底動脈的舒張作用、基底

3、動脈的EDHF反應(yīng)、PPG對EDHF舒張作用的影響、NaHS及L-cys對血管的舒張作用、TFR對血管的舒張作用及其EDHF機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集各組血管管腔內(nèi)灌流液,用以檢測H2S的含量。
　　2.細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn),研究ACh對大鼠基底動脈平滑肌細(xì)胞膜電位的超極化作用及內(nèi)源性和外源性EDHF的超極化作用。
　　3.原代培養(yǎng)大鼠基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞,采用RT-PCR的方法檢測內(nèi)源性合成硫化氫的酶的表達(dá),并觀察ACh及TFR對酶

4、表達(dá)的影響。
　　4.在體結(jié)扎冠脈前降支致心肌缺血損傷模型,TFR預(yù)處理給藥,檢測心肌梗死面積、血清中cTnI、NO含量,western blot方法檢測心肌組織中iNOS的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中,用30 mmol/L的KCl或10-7 mol/L的U46619預(yù)收縮的大鼠基底動脈,ACh均可產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用,其最大舒張率分別是80.97±1.27％和80.84±5.1

5、0%,與溶媒對照組比較差異有顯著性(P＜0.01);而去除血管內(nèi)皮后,ACh的舒張作用消失。
　　2.應(yīng)用NO合酶抑制劑(L-NAME,3×10-5mol/L)和PGI2合酶抑制劑(Indo,10-5mol/L)后,ACh對基底動脈還存在部分舒張作用,其最大舒張率分別是31.51±3.55(KCl)%和38.87±3.48(U46619)%,與溶媒對照組比較差異有顯著性(P＜0.01);在細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用L-NAME和I

6、ndo后,ACh對大鼠基底動脈平滑肌細(xì)胞的超極化作用并未被完全抑制,其最大超極化作用為-63.11±4.47 mV,與溶媒對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。此結(jié)果表明,在大鼠基底動脈中,這種非NO、非PGI2、內(nèi)皮依賴的超極化及舒張血管作用可能為EDHF的作用。
　　3.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),10-5-10-2.5mol/L NaHS(H2S外源性供體)可產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用;同時,在細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn)中也發(fā)

7、現(xiàn),10-5-10-2.5mol/L NaHS具有濃度依賴性超極化血管平滑肌細(xì)胞的作用。
　　4.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性合成硫化氫的酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的阻斷劑DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG,10-4mol/L)可以抑制EDHF引起的血管舒張作用,與未用阻斷劑組比較差異有顯著性(P＜0.01);同樣,在細(xì)胞膜電位記錄實(shí)驗(yàn)

8、中也發(fā)現(xiàn),PPG可以明顯抑制EDHF對基底動脈平滑肌細(xì)胞的超極化作用,與不加阻斷劑組相比差異有顯著性(P＜0.05 or P＜0.01)。
　　5.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),合成硫化氫的底物L(fēng)-半胱氨酸(L-cysteine,L-cys,10-5-10-2.5mol/L)可產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用;去除血管內(nèi)皮后L-cys的舒張作用被部分抑制。
　　6.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中,收集血管內(nèi)腔灌流液,用來檢測H2S

9、的含量,結(jié)果顯示大鼠基底動脈基礎(chǔ)狀態(tài)下就有H2S的產(chǎn)生,其含量為3.92±0.25×10-5 mol/L,用ACh聯(lián)合L-NAME,Indo灌流結(jié)束后H2S的含量有明顯的增加,與基礎(chǔ)含量比較差異有顯著性(P＜0.01),而加用PPG(10-4mol/L)預(yù)灌后H2S的含量明顯降低(P＜0.01)。
　　7.在原代培養(yǎng)的大鼠基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞中,采用RT-PCR的方法檢測合成硫化氫的酶的表達(dá),結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)CSE而不表達(dá)

10、CBS;而且ACh(10-4.5mol/L)可以上調(diào)基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞中CSE的表達(dá)。
　　8.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),TFR(0.011~2.7g/L)對大鼠基底動脈具有明顯的濃度依賴性舒張作用;去除血管內(nèi)皮細(xì)胞后,TFR的舒張作用被部分抑制;在血管內(nèi)腔灌流液中用L-NAME(3×10-5mol/L)和Indo(10-5mol/L)預(yù)灌30min后,TFR舒張作用被部分抑制。結(jié)果表明在TFR舒張基底動脈的作用中除NO和P

11、GI2外,尚有EDHF機(jī)制的參與。
　　9.在離體血管舒縮功能測定實(shí)驗(yàn)中,用L-NAME(3×10-5mol/L),Indo(10-5mol/L)和PPG(10-4mol/L)同時預(yù)灌30min后,TFR舒張作用被部分抑制,與僅用L-NAME和Indo預(yù)灌組比較差異有顯著性;TFR灌流結(jié)束后,血管內(nèi)腔灌流液中H2S的含量有明顯的增加,與基礎(chǔ)生成量比較差異有顯著性,聯(lián)合L-NAME, Indo預(yù)灌組,H2S的含量較基礎(chǔ)生成量也明顯增

12、加,而加用PPG預(yù)灌后H2S的含量則明顯降低。RT-PCR半定量結(jié)果顯示,TFR(2.7g/L)可以上調(diào)大鼠基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞CSE的mRNA表達(dá)水平,與溶媒對照組比較,差異有顯著性(P＜0.01)。此結(jié)果進(jìn)一步提示,在TFR擴(kuò)張基底動脈的機(jī)制中有EDHF作用的參與。
　　10.在結(jié)扎冠脈前降支致心肌缺血損傷模型中發(fā)現(xiàn),TFR預(yù)處理具有明顯的抗心肌缺血再灌注損傷的作用,可以降低心肌梗死面積,明顯抑制急性心肌梗死造成的血清中cTnI的

13、升高,增加血清中NO含量,上調(diào)心肌組織中iNOS的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠基底動脈中,乙酰膽堿可產(chǎn)生非NO、非PGI2、內(nèi)皮依賴的超極化及舒張血管作用,即EDHF反應(yīng);
　　2.在原代培養(yǎng)的大鼠基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞中,有內(nèi)源性合成的酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的表達(dá),而且CSE的抑制劑可以抑制這種非NO、非PGI2、內(nèi)皮依賴的超極化及舒張血管作用,同時發(fā)現(xiàn)Na