點(diǎn)陣CO2激光對Wistar大鼠皮膚光老化影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　 皮膚光老化(photoaging)是指由于長期的日光照射導(dǎo)致皮膚衰老或加速衰老的現(xiàn)象。人們通常把由于遺傳及不可抗拒的因素（如地心引力、機(jī)體重要器官的生理功能減退等）引起的皮膚內(nèi)在性衰老稱為自然老化，把由于環(huán)境因素如紫外線(ultraviolet，UV)輻射、吸煙、風(fēng)吹及接觸有害化學(xué)物質(zhì)引起的皮膚衰老稱為外源性老化。由于日光中紫外線輻射是環(huán)境因素中導(dǎo)致皮膚老化的主要因素，所以通常所說的外源性皮膚老化即指皮膚光老化

2、。
　　 長期、過量的日光照射影響皮膚的多種細(xì)胞成分和組織結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為表皮不均一增厚或萎縮、黑素細(xì)胞不規(guī)則增生或減少、真皮毛細(xì)血管排列紊亂、彎曲擴(kuò)張、真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤等等。最具有特征性的變化是日光引起的真皮基質(zhì)成分的變化。
　　 真皮基質(zhì)成分包括除了水以外的所有細(xì)胞間物質(zhì)，其中最主要的成分是彈力纖維、膠原纖維、氨基多糖和蛋白多糖等，這些物質(zhì)均由真皮成纖維細(xì)胞合成。在人類皮膚的自然衰老過程中，彈力纖維進(jìn)行性降解、片段化直

3、至消失。而日光中紫外線照射可使彈力纖維變性，出現(xiàn)變形，纖維增粗、扭轉(zhuǎn)、分叉，日積月累可使變性的彈力纖維呈團(tuán)塊狀堆積，其彈性和順應(yīng)性則隨之喪失，皮膚出現(xiàn)松弛、過度伸展后出現(xiàn)裂紋。
　　 與光老化有關(guān)的另一種基質(zhì)成分是膠原纖維。成年人皮膚中主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原約占皮膚膠原成分的80％，在真皮中聚集成與皮面平行的粗大纖維束，相互交織成網(wǎng)，具有高度機(jī)械穩(wěn)定性，是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，也是維持皮膚飽滿充盈的物質(zhì)基

4、礎(chǔ)。Ⅲ型膠原是幼稚、纖細(xì)的膠原纖維，是構(gòu)成網(wǎng)狀纖維的主要成分，日光照射可影響Ⅰ型膠原的形成，Ⅲ型膠原相對增加，最終導(dǎo)致成熟的膠原束減少，皮膚出現(xiàn)松弛和皺紋?；|(zhì)中的其它成分如氨基多糖和蛋白多糖也和光老化有關(guān)。
　　 日光中的紫外線輻射并非直接破壞上述真皮細(xì)胞及基質(zhì)成分。而是可以引起真皮的炎癥反應(yīng)，尤其是激活血管周圍的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，引起免疫細(xì)胞浸潤，炎性介質(zhì)以及細(xì)胞因子可導(dǎo)致組織溶解酶如彈性蛋白酶、膠原酶的釋放，進(jìn)而緩慢溶解

5、上述基質(zhì)成分?；钚匝醮?Reactiveoxygenspecies，ROS)在光老化形成過程中起重要作用。UV照射可通過直接、間接等多種途徑使皮膚中ROS濃度異常升高，高濃度的ROS可滅活基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子，抑制前膠原蛋白合成，并對正常膠原纖維有直接破壞作用，在光老化皮膚膠原成分損傷中也起一定的作用。同時(shí)，UV輻射的作用與受體和配體的作用相似，能激活細(xì)胞表面生長因子受體和細(xì)胞因子受體，受體激活又導(dǎo)致了下游獨(dú)特的信號(hào)傳導(dǎo)路徑中組成成分

6、的激活，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)光老化。
　　 UV照射導(dǎo)致的皮膚光老化主要與免疫抑制和免疫耐受相關(guān)。無論是細(xì)胞水平還是分子水平，UV的抑制表現(xiàn)為復(fù)雜的、相互關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)作用。
　　 進(jìn)行皮膚光老化相關(guān)發(fā)病及防治機(jī)制的研究很難回避有創(chuàng)取材的問題，由于好發(fā)于暴露部位及相關(guān)的倫理學(xué)要求，需要建立一種模擬性強(qiáng)、操作簡便、評價(jià)指標(biāo)明確的光老化動(dòng)物模型。一直以來，研究多以小鼠、大鼠、豚鼠為主要光老化造模動(dòng)物。有人用Wistar大

7、鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每天照射UVA+UVB，照射8周后出現(xiàn)典型皮膚光老化表現(xiàn)。在造模過程中，紫外線照射劑量是最關(guān)鍵、也是最難確定的因素。造模時(shí)間一般應(yīng)該在一個(gè)月以上。也有人用光敏劑加速造模進(jìn)程的，Tsunemichi等認(rèn)為，臨床上光化學(xué)療法中應(yīng)用最多的8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP），在皮膚的吸收可明顯促進(jìn)縮短UVA的作用波長，從而促進(jìn)光老化作用，因此，使用光敏劑會(huì)加速光老化模型的造模過程。
　　

8、光老化的防治策略有多種，點(diǎn)陣激光已愈來愈多地應(yīng)用于改善皮膚光老化。
　　 皮膚光老化治療的核心是刺激真皮組織基質(zhì)成分，如膠原纖維、彈力纖維的新生和重排。真皮受熱刺激后的反應(yīng)被認(rèn)為是很重要的治療機(jī)制:當(dāng)激光光束直徑調(diào)節(jié)到數(shù)百微米以下作用于皮膚后，在一定的能量密度下，無論是熱變性還是真正孔徑的形成，這種損傷均會(huì)啟動(dòng)機(jī)體的程序化的創(chuàng)傷愈合過程，啟動(dòng)皮膚重建修復(fù)程序，最終導(dǎo)致包括表皮和真皮在內(nèi)的全層皮膚的重塑和重建，達(dá)到治療目的。

9、>　　 從損傷修復(fù)重建的角度來研究點(diǎn)陣激光，可涉及到Toll樣受體的變化。Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)屬于天然免疫的一類，是白細(xì)胞介素1受體/Toll樣受體超家族，主要分布于免疫細(xì)胞以及同外界相通的上皮細(xì)胞表面。TLRs可觸動(dòng)機(jī)體先天性免疫應(yīng)答，通過MyD88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)依賴和MyD88非依賴途徑啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)特異性基因表

10、達(dá)，分泌各種細(xì)胞因子，在啟動(dòng)機(jī)體防御性抗病原微生物免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。這一系列的變化與組織修復(fù)過程存在交叉重疊的反應(yīng)狀態(tài)，越來越多的研究顯示TLRs在組織再生重建，包括光老化的修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用。不同的TLRs識(shí)別不同的內(nèi)源性配體，如熱激蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)的分解物，是TLR2/TLR4的內(nèi)源性配體。內(nèi)源性配體，如大分子的降解物、蛋白水解物、破裂細(xì)胞的胞內(nèi)成分以及炎癥反應(yīng)產(chǎn)物，通過刺激TLRs信號(hào)傳通路的啟動(dòng)而加速傷口的愈合。機(jī)體

11、損傷之后，壞死細(xì)胞至少可以通過被TLR2識(shí)別來募集中性粒細(xì)胞并啟動(dòng)組織修復(fù)過程。細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸在組織損傷處可發(fā)生迅速降解，透明質(zhì)酸的可溶性低分子降解產(chǎn)物參與多種炎癥及修復(fù)過程，它們在樹突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)TLR4識(shí)別后可激活信號(hào)傳遞途徑。
　　 臨床上已經(jīng)證實(shí)剝脫性點(diǎn)陣激光可以治療光老化。但目前的研究主要集中在點(diǎn)陣激光治療的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，從微觀組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、分子水平等方面去研究治療機(jī)制的基礎(chǔ)性研究不多。
　　 目

12、的:
　　 我們以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮膚光老化模型的制備，探討Wistar大鼠在皮膚光老化動(dòng)物模型制造中的應(yīng)用及意義。并在此基礎(chǔ)上以點(diǎn)陣CO2激光對光老化皮膚進(jìn)行治療，觀察治療前后點(diǎn)陣CO2激光對光老化的影響，探討點(diǎn)陣CO2激光治療光老化的機(jī)制。
　　 方法:
　　 選取48只Wistar大鼠，其中實(shí)驗(yàn)組A1組16只，A2組16只;對照組B組11只;空白組C組5只。實(shí)驗(yàn)組A1組在照射紫外光前0.5小時(shí)

13、在裸露皮膚上外涂8-MOP溶液。A2組以UVB強(qiáng)度為0.12mW/cm2，UVA強(qiáng)度為1.05mW/cm2的UV照射10min，每天一次，連續(xù)照射8周。A1組以同樣強(qiáng)度的輻照，UVB每天照射10min，UVA每天照射120min;對照組B組大鼠不做照射處理。每2周觀察組織學(xué)、過氧化及抗氧化指標(biāo)MDA、SOD，羥脯氨酸含量等，評價(jià)光老化造模效果。造模成功后將實(shí)驗(yàn)組A2組隨機(jī)分成D組10只，E組5只。D組與對照B組做自身對照，以低能量點(diǎn)陣C

14、O2激光(ActiveFXTM治療頭，波長10600nm，光斑大小9mm×9mm，光點(diǎn)0.125mm，能量50mJ/cm2，頻率5Hz，重復(fù)延遲時(shí)間0.5s，10％覆蓋率)與高能量CO2激光（能量150mJ/cm2，其余參數(shù)同）照射D組與對照B組背部，E組與空白組C組不做處理。分別于治療后1天、1周、2周、3周、4周取材，HE染色觀察皮膚組織學(xué);硫代巴比妥酸比色法、黃嘌呤氧化酶法測過氧化及抗氧化指標(biāo)(MDA、SOD);對二甲氨基苯甲醛分

15、光光度法測羥脯氨酸含量、以及Western-Blot法測TLR2、TLR4含量的變化。所有數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組計(jì)量資料以((X)±S)表示;計(jì)數(shù)資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性時(shí)采用one-way(ANOVA)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD);不齊時(shí)采用Welch校正方法，資料不符合正態(tài)分布或方差不齊者以非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。多組間樣本均數(shù)的比較采用重復(fù)測量的方差

16、分析，Mauchly球型檢驗(yàn)不滿足球形假設(shè)用校正系數(shù)(Greenhouse-Geisser)來校正自由度，以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.光老化動(dòng)物造模結(jié)果:
　　 1.1.實(shí)驗(yàn)組A1組、A2組分別在第4周、第8周出現(xiàn)典型慢性光老化的皮膚臨床體征及組織學(xué)表現(xiàn)。但A1組有56％(9/16)的死亡率。
　　 1.2.在造模的早期，在UV照射下，從第2周開始，無論是A1組還是A2實(shí)驗(yàn)組

17、，大鼠皮膚中MDA含量就已經(jīng)升高，并且隨著光老化的進(jìn)程而不斷增加。而對照B組皮膚中MDA的含量基本保持穩(wěn)定。
　　 1.3.在造模的早期，在UV照射下，從第2周開始，無論是A1組還是A2實(shí)驗(yàn)組，大鼠皮膚中SOD的含量就已經(jīng)降低，并且隨著光老化的進(jìn)程而不斷下降。而對照B組皮膚中SOD的含量基本保持穩(wěn)定。
　　 1.4.在造模的早期，在UV照射下，從第2周開始，無論是A1組還是A2實(shí)驗(yàn)組，大鼠皮膚中Hyp含量就已經(jīng)開始降低，

18、并且隨著光老化的進(jìn)程而不斷下降。而對照B組皮膚中Hyp的含量基本保持穩(wěn)定。
　　 2.不同能量點(diǎn)陣激光治療光老化D組（高能量激光治療組為D1組，低能量激光治療組為D2組）、對照組B組（高能量激光治療組為B1組，低能量激光治療組為B2組），以及未作處理的E組、空白組C組結(jié)果:
　　 2.1.隨著時(shí)間的推移，激光治療組D組光老化皮膚的肉眼觀及組織學(xué)改善明顯，對照組B組切片顯示新生的膠原纖維增加，未作處理的E組光老化沒有變化。

19、
　　 2.2.實(shí)驗(yàn)期間，空白組C組與不做處理的E組的MDA含量基本保持不變。隨著治療后時(shí)間的推移，激光治療光老化組的MDA含量逐漸下降，并且以高能量激光治療組D1組的下降為快，到第3周已基本恢復(fù)空白組C組的正常水平;而低能量激光治療光老化組雖然有下降，但第4周仍未降至空白C組的正常水平。對照B組在處理初期升高，1周下降至正常水平。
　　 2.3.激光治療后D組SOD含量逐漸升高，到第3、4周保持相對平穩(wěn)，回升到正常水平

20、;就能量差異而言，從第3周開始，D組的SOD含量不受能量高低因素的限制。對照B組SOD的含量在第2周達(dá)到高峰后開始下降，第4周時(shí)已經(jīng)回歸到治療前正常水平，并且對照B組SOD的含量不受能量高低差異的影響。
　　 2.4.隨著治療后時(shí)間的延長，激光治療光老化的D組與激光治療對照B組中的Hyp含量在不斷的增加，在第4周，激光治療光老化的D組的Hyp含量已經(jīng)恢復(fù)到正常水平。就能量因素而言，高能量激光與低能量激光能引起光老化D組的Hyp含

21、量的不同變化;但正常對照B組中則沒有能量因素的差別。
　　 2.5.激光治療光老化組D組中TLR2/TLR4隨著時(shí)間、能量的變化而改變。從均數(shù)上看，兩者的表達(dá)在第1天達(dá)到最高峰，在第2周降至最低，后逐漸恢復(fù)。激光處理對照組B組則不受能量差異的影響。
　　 結(jié)論:
　　 1.以Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以構(gòu)建光老化皮膚模型，在組織學(xué)上、分子生物學(xué)上能模擬人體皮膚光老化的特征性改變。
　　 2.點(diǎn)陣CO2