單壁碳納米管對(duì)線粒體電子傳遞體系功能的影響.pdf

1、目的:探索和研究單壁碳納米管(SWCNTs)對(duì)線粒體電子傳遞體系(METC)功能的影響。
　　方法:SWCNTs分散于PBS經(jīng)過(guò)超聲制備成懸液;通過(guò)SWCNTs對(duì)FITC的物理吸附，實(shí)現(xiàn)FITC對(duì)SWCNTs的熒光標(biāo)記;通過(guò)透射電鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)對(duì)SWCNTs粒徑和形態(tài)進(jìn)行表征。以CCK-8法研究SWCNTs對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)生理鹽水對(duì)照組、濃度分別為0.5、1.5、3、6、

2、12、24μg/ml的SWCNTs實(shí)驗(yàn)組，HepG2細(xì)胞分別與SWCNTs共孵育24、48和72 h后，測(cè)定SWCNTs對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖毒性，然后通過(guò)光鏡和AFM對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行表征，激光共聚焦觀測(cè)線粒體膜電位的變化，并使用流式細(xì)胞儀測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS的含量和SWCNTs對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;采用蔗糖濃度梯度差速離心法提取HepG2細(xì)胞線粒體，分離出線粒體可溶性蛋白，分別測(cè)定線粒體四個(gè)呼吸酶復(fù)合物活性變化;使用酶標(biāo)儀

3、測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量;采用魚藤酮(ROT)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)、抗霉素A(ANT)和二苯碘(DPI)四種線粒體呼吸酶復(fù)合物特異性抑制劑，聯(lián)合使用SWCNTs，分別作用于離體小鼠肝臟細(xì)胞線粒體，測(cè)定線粒體FADH2、NADH兩條電子傳遞鏈ROS的生成量。
　　結(jié)果:透射電鏡下SWCNTs成空心管狀結(jié)構(gòu);通過(guò)FITC對(duì)SWCNTs的熒光標(biāo)記，可以在熒光顯微鏡下觀察SWCNTs可以進(jìn)入HepG2細(xì)胞以及進(jìn)入

4、細(xì)胞所需時(shí)間，SWCNTs-FITC和HepG2細(xì)胞孵育后，2h左右可以進(jìn)入到HepG2細(xì)胞內(nèi)部。HepG2細(xì)胞和SWCNTs孵育24 h后，在光鏡下，對(duì)照組HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，呈扁平梭型或不規(guī)則多角形，SWCNTs孵育24 h后，低濃度組(1.5μg/ml)細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化，但培養(yǎng)液中漂浮死亡細(xì)胞增多;中濃度組(12μg/ml)細(xì)胞間隙變大，發(fā)生形態(tài)改變，死亡細(xì)胞明顯增多;高濃度組(24μg/ml)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)

5、則，細(xì)胞貼壁能力下降，死亡細(xì)胞進(jìn)一步增多。原子力顯微鏡下SWCNTs組HepG2細(xì)胞相比于空白對(duì)照組細(xì)胞開始發(fā)生皺縮，體積變小，細(xì)胞周圍粘附物減少，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多不規(guī)則凹陷。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著SWCNTs孵育濃度和時(shí)間的增加，SWCNTs對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率而增加。在細(xì)胞內(nèi)ROS含量和線粒體膜電位測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到隨著SWCNTs孵育濃度的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)部的ROS含量隨之增加，而線粒體膜電位降低，結(jié)果

6、均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。采用蔗糖濃度梯度差速離心法提取的線粒體通過(guò)Clark氧電極活性測(cè)定，證明線粒體活性良好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求;在透射電鏡下，可以觀察到SWCNTs可以進(jìn)入到線粒體和細(xì)胞核等細(xì)胞器內(nèi)部，造成線粒體腫脹、脊減少甚至消失、最終線粒體雙層膜破裂。通過(guò)對(duì)線粒體四個(gè)電子傳遞鏈復(fù)合物活性的分離測(cè)定，SWCNTs可以明顯地抑制復(fù)合物Ⅰ，復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ的活性，在3～12μg/ml孵育濃度下，上述三個(gè)復(fù)合物活性均顯著低于對(duì)

7、照組(P＜0.05)，在1.5～3μg/ml濃度孵育下，復(fù)合物Ⅱ活性與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異，但在6μg/ml濃度孵育下，復(fù)合物Ⅱ活性明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。MDA檢測(cè)結(jié)果表明，在1.5～3μg/ml孵育濃度下，SWCNTs組HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，但在6～24μg/ml濃度孵育下，HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。在對(duì)NADH電子傳遞鏈ROS生成檢測(cè)試驗(yàn)中，在control組，D

8、PI組ROS含量低于空白組(P＜0.5)，其余抑制劑組均高于空白組(P＜0.5)，在SWCNTs處理組，DPI組含量與空白組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SWCNTs+ROT組、SWCNTs+ANT組和SWCNTs+ROT+ANT組ROS含量均高于SWCNTs組(P＜0.5)。SWCNTs+ROT+DPI組ROS低于SWCNTs+ROT組。在對(duì)FADH2電子傳遞鏈ROS生成檢測(cè)試驗(yàn)中，在control組，與空白組相比，ROT、DPI和ROT+DPI

9、組ROS含量降低(P＜0.5)，TTFA組ROS含量增加(P＜0.5)，在SWCNTs處理組，與空白組相比，三個(gè)抑制劑組ROS含量差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義SWCNTs+TTFA組和SWCNTs+ANT組ROS含量增加(P＜0.5)，而SWCNTs+ROT+TTFA組和SWCNTs+DPI+ANT組含量比SWCNTs+TTFA組減少(P＜0.5)。
　　結(jié)論:SWCNTs隨著與HepG2細(xì)胞孵育時(shí)間和濃度的增加，可以對(duì)HepG2細(xì)胞增殖產(chǎn)

10、生明顯的抑制作用。SWCNTs明顯抑制線粒體傳遞鏈復(fù)合物活性，導(dǎo)致電子傳遞效率降低。對(duì)于NADH電子傳遞鏈可能主要是作用于復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ的泛醌結(jié)合點(diǎn)，使該結(jié)合點(diǎn)電子漏出增加，而不是通過(guò)復(fù)合體Ⅰ的FMN位點(diǎn)漏出。對(duì)于FADH2電子傳遞鏈，是作用在復(fù)合體Ⅲ的泛醌結(jié)合點(diǎn)，導(dǎo)致電子漏出增加，并不是通過(guò)作用于復(fù)合體Ⅱ促進(jìn)電子從復(fù)合體Ⅱ向復(fù)合體Ⅰ回流，從復(fù)合體Ⅲ的泛醌結(jié)合位點(diǎn)漏出，電子漏出增加，使得ROS生成量增加。而ROS過(guò)量生成通過(guò)對(duì)含有兩