增強Foxp3基因表達對支氣管哮喘發(fā)病的干預研究.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是嚴重威脅人類健康的一種疾病，全世界有大約3億哮喘患者，每年有25000人死于哮喘。哮喘是由T淋巴細胞、嗜酸粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等多種炎癥細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道慢性炎癥導致氣道高反應(yīng)性(hyperresponsiveness，AHR)的形成和氣道重構(gòu)。哮喘引起的社會和家庭問題日益成為人類社會的沉重負擔。
　　 至今已發(fā)現(xiàn)有多種輔助性T細胞(helperTcell，Thcell)，包括Th1細胞

2、、Th2細胞、Th17細胞等等。在哮喘的發(fā)病機制中，針對環(huán)境中過敏原而產(chǎn)生的Th2型細胞因子起了重要的作用。研究表明Th1/Th2細胞平衡失調(diào)即Th0細胞向Th2細胞分化過度，在過敏性疾病的發(fā)生中起重要作用。Th2細胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等多種細胞因子來發(fā)揮促炎作用。在哮喘患者中，Th2細胞被激活，分泌一系列Th2型細胞因子來調(diào)節(jié)IgE的產(chǎn)生、炎癥細胞的浸潤、氣道粘膜高分泌及氣道結(jié)構(gòu)的改變。另一方面，機體對過

3、敏原免疫耐受缺陷亦是導致哮喘發(fā)生的主要原因之一，健康者對過敏原的反應(yīng)表現(xiàn)為免疫耐受從而避免Th2型反應(yīng)，而哮喘患者的耐受途徑存在異常從而不能對過敏原發(fā)生免疫耐受，誘導機體產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Tregs)，尤其是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Tregs)，在維持機體對過敏原的免疫耐受中起主要作用。CD4+CD25+Tregs約占正常人和小鼠的外周血及脾臟

4、組織CD4+T細胞的5％～10％。CD4+CD25+Tregs可分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β來發(fā)揮免疫抑制作用，能夠抑制Th2細胞分化、增殖及細胞因子的產(chǎn)生，對于Th2介導的疾病(如哮喘)是一種新的、有希望的治療途徑。Foxp3(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor)稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在CD4+CD25+Tregs特異性表達，且在幼稚前體T細胞向Tregs表型分化中起著重

5、要的作用。
　　 迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多因子能招募CD4+CD25+Tregs或誘導Foxp3在CD4+CD25-T細胞中表達，從而降低Th2細胞免疫反應(yīng)，抑制哮喘的病理過程和癥狀表現(xiàn)。但是這些研究都是利用全身性的方法，由于對體內(nèi)其他器官會有副作用，難免會產(chǎn)生潛在性的問題。所以我們希望在肺組織局部增強Foxp3基因的表達，來觀察其對哮喘的發(fā)生是否有保護作用。在本研究中，我們成功構(gòu)建了攜帶有小鼠Foxp3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-

6、-Foxp3/PMX，然后通過氣道滴注至OVA誘導的哮喘模型小鼠體內(nèi)，觀察小鼠肺組織炎癥、氣道高反應(yīng)性、肺組織中Th2及Tregs百分比、BALF中炎癥因子含量等的變化，同時檢測抑制性細胞因子IL-10和TGF-β的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)增強肺部Foxp3基因的表達對哮喘的發(fā)病有保護作用，本研究為哮喘的免疫治療提供了新的方向。
　　 目的：通過經(jīng)氣道滴注攜帶有小鼠Foxp3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，觀察增強肺部Foxp3基因表達對哮喘小鼠氣

7、道炎癥和氣道高反應(yīng)性的影響，對肺組織中Th2及Tregs細胞百分比的影響。
　　 方法：實驗采用BALB/c小鼠，分生理鹽水陰性對照組(Saline組)、哮喘組(OVA組)、Foxp3/PMX治療組(Foxp3組)及Empty/PMX治療組(Control組)四組，其中Foxp3/PMX治療組和Empty/PMX治療組分別經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX和Empty/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒，50μl/次，共3次。最后一次抗原激發(fā)后24小時

8、檢測小鼠氣道反應(yīng)性，Q-PCR和Westernblot分別檢測肺組織Foxp3基因和蛋白表達水平，肺組織病理切片分別行HE和PAS染色檢測炎癥細胞浸潤和氣道粘液分泌情況，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)行總細胞計數(shù)及炎癥細胞分類計數(shù)。ELISA法檢測BALF中細胞因子IL-4、IL-13、IL-17、IL-10及TGF-β水平，Q-PCR檢測肺組織IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、IL-10

9、及TGF-βmRNA表達水平。流式細胞術(shù)檢測肺組織單核細胞中CD4+Foxp3+T細胞及CD4+IL-4+T細胞占總的CD4+T細胞百分比。
　　 結(jié)果：①OVA組小鼠肺組織中Foxp3mRNA及蛋白水平均較Saline組小鼠明顯升高，OVA組小鼠肺組織淋巴細胞中CD4+Foxp3+T細胞、CD4+IL-4+T細胞均較Saline組小鼠明顯增加。經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒進一步增加肺組織中Foxp3mRNA及蛋白水平

10、，同時伴隨著CD4+Foxp3+T細胞百分比的增加及CD4+IL-4+T細胞百分比的減少。②OVA組小鼠氣道反應(yīng)性，BALF中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)，肺組織炎癥以及黏液分泌均較Saline組明顯增加。與Control組相比，經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒顯著降低了哮喘小鼠氣道反應(yīng)性、BALF中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)目，抑制了肺組織的氣道炎癥以及黏液分泌。③經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒降低了肺組織中Th2細胞及Th

11、17細胞免疫反應(yīng)相關(guān)的IL-4、IL-5、IL-13、IL-17AmRNA表達水平，降低了BALF中IL-4、IL-13、L-17細胞因子含量。④經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒增加了肺組織中抑制性細胞因子IL-10及TGF-βmRNA表達水平，及肺泡灌洗液中IL-10及TGF-β1細胞因子含量。
　　 結(jié)論：本實驗通過Foxp3/pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒氣道滴注至哮喘小鼠體內(nèi)，證明增強肺組織局部Foxp3基因的表達，可增加肺部C