TSP-1和TGF-β1表達與糖尿病大鼠多臟器損傷的研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病(diabetes Mellitus，DM)已成為世界上發(fā)病率最高、對人類健康威脅最嚴重的疾病之一。糖尿病所引起的糖代謝紊亂，導致微血管病變，以及高血糖本身對組織細胞的毒害作用，繼而引起一系列并發(fā)癥，包括糖尿病陽痿、糖尿病心肌病和糖尿病性癡呆等。對于糖尿病陽痿，有資料表明，大約一半患者在診斷為糖尿病10年后有可能合并勃起功能障礙(erectile disfunction，ED)，其中約有12％的糖尿病患者

2、ED是其首發(fā)表現(xiàn)。高血糖本身對心肌亦有毒害作用，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者70％以上死于心血管系統(tǒng)疾癮，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關。現(xiàn)已公認，糖尿病心肌病是一個獨立的原發(fā)病，其發(fā)病不依賴于高血壓、冠狀動脈疾病和其他已知心臟疾病。此外糖尿病與認知障礙和癡呆亦有密切相關性：如在歐洲，糖尿病發(fā)病率在

3、年齡大于65的癡呆患者中是6.4％。Leibson等報道了1455例成年發(fā)病的糖尿病病人中981人經(jīng)一年觀察后，101人產(chǎn)生了癡呆，其中77例為老年性癡呆。
　　 糖尿病上述多器官損傷的機制尚未完全明確，目前認為非酶性糖基化終末產(chǎn)物形成、蛋白激酶C信號通路的激活、氧化應激反應和已糖胺通路活性增高等具有重要作用。隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)上述糖尿病上述臟器損傷均存在間質(zhì)纖維化、相關細胞凋亡或突觸可塑性改變等病理變化，因此高血糖狀態(tài)下

4、TSP-1和TGF-β1表達的改變和上述糖尿病患者多臟器損傷之間的關系引起了我們關注。血小板反應素(Thrombospondin，TSP)，尤其是TSP-1，是重要的生理激活物之一，作為一種大分子的細胞外糖蛋白，最初是在被凝血酶刺激的血小板α顆粒釋放的產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，最新研究證實TSP并非血小板特有，可被腎小球系膜細胞，成纖維細胞等多種細胞分泌，許多組織如腎臟、心臟、軟骨和腦中都有TSP基因產(chǎn)物的表達，是許多不同組織細胞外間質(zhì)的重要成分。

5、研究發(fā)現(xiàn)TSP-1由3條相同肽鏈構(gòu)成的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，每條肽鏈由N端、C端球狀結(jié)構(gòu)域、原膠原同源區(qū)、type1重復序列、type2重復序列、type3重復序列組成。其中type1重復序列(thrombospondin type1 repeats，TSRs)由3個備解素樣基序(TSR1、TSR2、TSR3)組成。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一個分泌型的多肽信號分子超家族，在

6、哺乳動物組織中存在3種形式的TGF-β，分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1所占比例最高，活性最強。激活的TGF-β可使組織纖維化，引起纖維母細胞遷移，抑制膠原酶和其它金屬蛋白酶的活性，增加膠原產(chǎn)生，降低膠原降解，促進基質(zhì)沉積。研究表明，TSP-1分子KRFK序列可與L-TGF-β1的LAP區(qū)域結(jié)合，從而改變LAP的空間構(gòu)型，使TGF-β1上與受體結(jié)合的位點暴露，成為活化的TSP-1/L-TGF-β1。同時新

7、近研究發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)的血小板反應素與突觸的建立活化和形態(tài)功能可塑性改變均有密切關系。因此，我們提出如下假設：糖尿病狀態(tài)(如高糖等刺激)條件下引起體內(nèi)各類細胞TSP-1和TGF-β1表達的改變，從而促進上述細胞纖維和膠原增生，最后導致纖維化，進而引起糖尿病勃起功能障礙、糖尿病心肌病，此外TSP-1表達改變在海馬區(qū)亦可引起突觸可塑性的改變，因此上述通路改變亦可引起糖尿病學習記憶能力的下降。
　　 研究已經(jīng)表明，在哺乳動物中小干擾RNA(

8、siRNA)能通過對生物學上保守結(jié)構(gòu)的RNA進行干擾，從而抑制相應靶基因的表達。RNA干擾具有高度的序列特異性，能使靶蛋白的表達關閉。許多研究已經(jīng)證實RNA干擾能阻斷多種類型哺乳動物病毒的復制，抑制癌腫的生長。RNA干擾已經(jīng)被開發(fā)成為反向遺傳學的一個強有力的工具，并且已顯示出廣闊的治療學上的應用前景。因此，我們有理由假設針對性開發(fā)TSP-1的小干擾RNA無疑對高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元的損傷有一定的保護作用。
　　 我們通過研究高血糖狀

9、態(tài)下對海馬區(qū)神經(jīng)元TSP-1和TGF-β1的表達改變，同時設計siRNA對TSP-1的表達進行了基因沉默，并評估TSP-1表達下調(diào)對神經(jīng)元的形態(tài)及突觸形成的影響。期望能靶向干擾TSP-1表達，為搪尿病學習記憶能力下降的基因治療提供一定的體外實驗依據(jù)。
　　 第一部分：TSP-1和TGF-β1在糖尿病大鼠陰莖、心肌和海馬區(qū)表達改變的研究
　　 1、目的：
　　 研究TSP-1和TGF-β1蛋白和mRNA在糖尿病大鼠

10、陰莖、心肌和海馬區(qū)表達的改變情況，初步闡明TSP-1和TGF-β1通路參與了糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)下的上述臟器損傷。
　　 2、材料與方法：
　　 2.1、糖尿病大鼠模型的制備
　　 SD大鼠隨機分為糖尿病組和正常對照組，其中糖尿病組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)65mg/kg制成糖尿病模型，定期測尿糖、血糖及體重，以確保維持高血糖狀態(tài)。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，其余條件同上，

11、喂養(yǎng)6周。
　　 2.2、各臟器功能檢測
　　 2.2.1、行為學檢測
　　 成模6周后各組大鼠分別進行Morris水迷宮實驗(觀察指標為逃避潛伏期和搜索策略)，以檢測糖尿病動物的學習、記憶能力的變化。
　　 2.2.2、陰莖勃起功能檢測
　　 成模6周后各組大鼠采用頸部皮下注射鹽酸阿樸嗎啡(APO)溶液(150ug/kg)，劑量約1ml，持續(xù)觀察30min，對其陰莖勃起情況進行檢測。
　　

12、 2.2.3、心功能檢測
　　 成模6周后各組大鼠充分麻醉后處死開胸，迅速取出心臟，置于4℃K-H液中除去血液，然后迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff灌流裝置上，用改良K-H液行常規(guī)逆行恒壓灌注(76mmHg)，觀察平衡灌注末的心臟作功量(rate-pressureproduct，RPP)，即心率*左室發(fā)展壓(HR*LVDP)的變化。
　　 2.3、各臟器組織的病理變化觀察
　　 成模6周后各組大鼠麻醉處死

13、，分別取陰莖組織、心臟和腦，制作石蠟切片，HE染色觀察其病理改變，同時取心臟和海馬區(qū)組織塊制作電鏡包埋和切片，電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 2.4、免疫組化和實時熒光定量PCR法檢測TSP-1和TGF-β1的表達
　　 成模6周后各組大鼠麻醉處死，分別取陰莖組織、心臟和腦，制作石蠟切片，采用免疫組化ABC法觀察上述各組織TSP-1和TGF-β1蛋白的表達，同時Trizol試劑盒提取細胞總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDN

14、A，rt-qPCR法檢測TSP-1和TGF-β1的基因轉(zhuǎn)錄情況。
　　 2.5、統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1、體重、血糖和尿糖檢測結(jié)果
　　 各組大鼠成模前，其體重、血糖和尿糖檢測結(jié)果兩組間無顯著性差異，成模6周后，糖尿病組體重251.6±27.4g，血

15、糖基本維持在19.8±2.8mmol/L，尿糖為++～+++。正常組大鼠體重397.4±21.3g，血糖為5.1±0.5mmol/L，尿糖陰性。兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　 3.2、各臟器功能
　　 行為學Morris水迷宮實驗顯示，正常組大鼠第1天的逃避潛伏期為(40.1±26.0)s；第2天為(24.8±14.2)s；第3天為(13.4±4.8)s；穿臺次數(shù)為(6.1±3.8)；糖尿病組大鼠第1天的逃

16、避潛伏期為(71.6±33.7)s；第2天為(43.4±13.8)s；第3天為(26.9±19.1)s，穿臺次數(shù)為(3.2±1.3)，上述差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　 檢測其陰莖勃起功能發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠單位時間勃起次數(shù)和勃起率(1.4±0.5次/30min和40％)明顯低于正常對照組大鼠(2.4±0.8次/30min和100％)(P<0.01)。
　　 心功能檢測顯示糖尿病組大鼠RPP值明顯低于正常組大鼠，(

17、P<0.01)。
　　 3.3、各臟器病理改變
　　 各臟器組織HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠陰莖白膜厚度的增加，陰莖膠原纖維破壞，失去了其特有的起伏的外觀，同時內(nèi)皮和平滑肌細胞也退化及間質(zhì)細胞增殖。糖尿病大鼠心肌細胞有不同程度的間質(zhì)纖維化和心肌肥厚，心肌纖維出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性的稀疏。電鏡下可見糖尿病大鼠心肌微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，心肌細胞肌原纖維片狀壞死、溶解，肌小節(jié)失去正常結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)心肌細胞凋亡或壞死等現(xiàn)象。糖尿病大鼠海馬區(qū)電

18、鏡觀察可見神經(jīng)元內(nèi)部線粒體嵴消失，神經(jīng)元之間突觸結(jié)構(gòu)蛻變，同時海馬區(qū)單位面積突觸數(shù)目明顯少于正常組大鼠。
　　 3.4、免疫組化和rt-PCR檢測結(jié)果
　　 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠各組織中TSP-1和TGF-β1的蛋白表達較正常對照組均明顯上調(diào)，其中糖尿病組大鼠陰莖、心臟和海馬區(qū)TSP-1和TGF-β1的單位面積陽性細胞數(shù)量均明顯高于正常對照組(P<0.05)，同時和實時熒光定量PCR法結(jié)果顯示TSP-1和TGF-

19、β1mRNA表達較正常對照組亦明顯上調(diào)(分別是對照組的2.8folds，1.7folds，6.6folds和6.9folds，4.3folds，1.42folds)。
　　 4、結(jié)論：
　　 STZ誘導的糖尿病大鼠出現(xiàn)血糖增高、尿糖強陽性、體重增加不明顯等一般情況改變，而且大鼠勃起功能、心功能和學習記憶能力均不同程度下降，同時伴陰莖、心臟和海馬區(qū)不同程度的病理改變，此外糖尿病大鼠各組織中TSP-1和TGF-β1的蛋白和m

20、RNA表達較正常對照組大鼠亦明顯上調(diào)。
　　 第二部分：siRNA靶向干擾TSP-1對高血糖培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài)和TSP-1表達改變的影響
　　 1、目的：
　　 明確siRNA靶向干擾TSP-1可有效改善高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元形態(tài)改變和TSP-1/TGF-β1的表達，以及保護神經(jīng)元形態(tài)和突觸連接。
　　 2、材料與方法：
　　 2.1、細胞培養(yǎng)
　　 取孕16天SD大鼠，0.5％戊巴比妥鈉麻醉，打

21、開子宮，取出胎鼠，取大腦并分離海馬。研磨組織并通過200目的濾網(wǎng)，收集細胞懸液，離心、重懸。接種于1×Polylysine包被的6孔培養(yǎng)板以及有小圓玻片的48孔培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨機分為正常培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)+轉(zhuǎn)染組、高糖培養(yǎng)+陰行轉(zhuǎn)染組、高糖培養(yǎng)+空白轉(zhuǎn)染組。
　　 2.2、siRNA制備與轉(zhuǎn)染
　　 各對siRNA序列如下TSP-1sence
　　 5’-UACACUUGG

22、CACCAGCAAAGCAGGG-3’，LacZ引物序列上游引物
　　 5’-ACCAGAAGCGGRGCCGGAAA-3’下游引物
　　 5’-CCACAGCGGATGGTTCGGAT-3’，上述siRNA由英維捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。上述細胞準備后，進行轉(zhuǎn)染，而后輕輕振蕩混勻，5％二氧化碳、37℃濕化空氣中常規(guī)培養(yǎng)48小時。
　　 2.3、掃描電鏡觀察
　　 上述細胞培養(yǎng)48小時后，吸干鋪有小圓

23、玻片48孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，4℃生理鹽水洗1次，2.5％戊二醛固定1h，0.01MPBS洗2次，每次15min，1％鋨酸固定1h，0.1MPBS溶液漂洗2次，每次15分鐘。梯度酒精脫水，100％丙酮脫水20min。用50％醋酸異戊酯置換15min，100％醋酸異戊酯置換15min，臨界點干燥，粘臺，鍍金，上機觀察。
　　 2.4、免疫組化檢測及WesternBlot檢測
　　 上述細胞培養(yǎng)48小時后，0.01MPBS含0

24、.3％的TRITONX-100(pH值7.4，PBS-T)分別洗凈，然后沉浸含2％正常山羊血清的PBS2小時，TSP-1或TGF-β1抗體(1:100)和含有1％的牛血清白蛋白的PBS中4℃過夜，PBS(3×5min)洗凈，生物素標記的羊抗兔IgG(1:200)孵育4h，PBS(3×5min)洗凈，免疫標記diaminobenzdine0.05％，加0.3％H2O2的PBS，染色，鏡下控制反應時間，然后用乙醇和二甲苯梯度脫水。其中PBS

25、被用來代替一抗作為陰性對照。
　　 等量提取的蛋白裝載到SDS/PAGE膠上并被分離后，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用含有5％脫脂奶粉的TBST液封閉1小時，再分別用TSP-1或TGF-β1抗體(1:100)在常溫下孵育，膜用TBST液洗滌4次，然后用抗鼠IgG-HRP(DAKO)在常溫下孵育1小時，最后蛋白用ECL體系進行檢測。蛋白相對表達量=待測蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值。
　　 2.5、統(tǒng)計學分析
　　

26、所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1、掃描電鏡觀察
　　 各組培養(yǎng)細胞掃描電鏡可見，正常組神經(jīng)元表面細胞微絨毛結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元間聯(lián)系廣泛而緊密，高糖培養(yǎng)組神經(jīng)元細胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)缺失，伴脫落，細胞膜可見輕微破損，神經(jīng)元間聯(lián)系稀疏，而RNA轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元上述病變較輕，同時陰性轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元顯示和高糖培

27、養(yǎng)組程度類似的損傷。
　　 3.2、免疫組化檢測及WesternBlot檢測結(jié)果
　　 通過檢測神經(jīng)元TSP-1和TGF-β1蛋白表達來評估TSP-1siRNA對神經(jīng)元上述蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1siRNA轉(zhuǎn)染組TSP-1和TGF-β1蛋白的表達與高糖培養(yǎng)組相比顯著地減少(P<0.01)。
　　 4、結(jié)論：
　　 通過siRNA靶向干擾TSP-1能有效改善高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元形態(tài)改變和TSP-1和