2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、肝功能衰竭是各種嚴(yán)重肝病的終末期表現(xiàn),肝移植是肝功能衰竭治療的最有效手段,但供肝來源的緊缺限制了肝移植的廣泛使用。以培養(yǎng)肝細(xì)胞為材料的體外生物人工肝支持系統(tǒng)有望為肝功能衰竭患者等待肝移植或通過自身肝再生恢復(fù)提供過渡的“橋梁”。迄今為止,幾種新型的生物人工肝己進(jìn)入Ⅱ~Ⅲ期臨床試驗(yàn),并取得了令人鼓舞的結(jié)果。生物人工肝的三大要素是生物反應(yīng)器、肝細(xì)胞和體外裝置,其中,生物反應(yīng)器是生物人工肝的核心部分,其性能直接關(guān)系到生物人工肝支持治療的效果和作

2、用。故生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和構(gòu)建在生物人工肝研究與臨床應(yīng)用中具有重要的意義。 隨著生物人工肝研究的不斷深入,圍繞著為肝細(xì)胞提供良好的生長、代謝環(huán)境和為肝功能衰竭患者血液或血漿與肝細(xì)胞相互作用、進(jìn)行物質(zhì)交換提供理想的場所兩大基本功能,在傳統(tǒng)中空纖維型生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上,一些新的生物反應(yīng)器不斷出現(xiàn),歸納起來主要為四大類:中空纖維型、灌流式/支架型、細(xì)胞包裹/懸液型、平板式生物反應(yīng)器。其中中空纖維型生物反應(yīng)器具有較強(qiáng)的免疫阻隔和物質(zhì)傳輸作

3、用,但肝細(xì)胞培養(yǎng)效果較差,灌流式/支架型生物反應(yīng)器具備良好的肝細(xì)胞培養(yǎng)效果,而缺乏免疫阻隔和灌流不均。如果能夠?qū)⒐嗔魇?支架型與中空纖維型生物反應(yīng)器有效結(jié)合,可揚(yáng)長避短,這種雜交型生物反應(yīng)器尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和構(gòu)建雜交型生物反應(yīng)器,力求實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞培養(yǎng)、物質(zhì)傳輸、免疫阻隔三者的完美結(jié)合,提高生物反應(yīng)器的性能和肝支持效果,為生物人工肝治療肝功能衰竭提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)選擇有代表性的6種半透膜材料進(jìn)行肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)

4、培養(yǎng),通過檢測細(xì)胞LDH漏出量和DNALadder細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)膜材料的細(xì)胞毒性,觀察各種膜材料上L02細(xì)胞的貼壁率、細(xì)胞活性、DNA總量、總蛋白合成和CYP1A2活性等,篩選出肝細(xì)胞相容性最佳的半透膜材料用于中空纖維制備。 利用非對(duì)稱性冷卻成型技術(shù)制備單內(nèi)皮層PES平板膜和中空纖維,采用多種顯微鏡觀察制備的平板膜和中空纖維結(jié)構(gòu),著重分析L02細(xì)胞在PES平板膜和中空纖維上的形態(tài)、生長曲線、白蛋白合成、LDL攝取、生物轉(zhuǎn)化等功能,

5、以評(píng)價(jià)制備的PES平板膜和中空纖維對(duì)肝細(xì)胞粘附、生長、增殖和功能表達(dá)的支持效果。 應(yīng)用一步發(fā)泡技術(shù)制備聚氨酯多孔支架材料,并與商品化的殼聚糖、聚乳酸-聚羥乙酸酯三維支架材料對(duì)比,根據(jù)材料的肝細(xì)胞相容性、孔隙率、孔徑、和物理特性等,確定用于生物反應(yīng)器構(gòu)建的三維支架材料,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用鼠尾膠原或纖維蛋白凝膠進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),以提高該支架材料對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)的支持效果。 在上述研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建PES中空纖維和聚氨酯多孔支架雜

6、交的三維立體式生物反應(yīng)器。利用血漿循環(huán)評(píng)價(jià)該反應(yīng)器的物質(zhì)傳輸能力;通過纖維蛋白凝膠進(jìn)行反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的凝膠化培養(yǎng),觀察反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)肝細(xì)胞的形態(tài)和分布,檢測凝膠化反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞功能的表達(dá),以評(píng)價(jià)反應(yīng)器的性能;采用體外人工肝實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)生物反應(yīng)器對(duì)重型肝炎病人血漿的肝支持作用。 本實(shí)驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下: 1.在各種膜材料上培養(yǎng)L02細(xì)胞的LDH漏出量與對(duì)照組無顯著差異,提取的細(xì)胞DNA電泳未見DNALadder。細(xì)胞在PES膜

7、上的貼壁率顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜,與對(duì)照組和PSF膜無顯著差異,PSF膜顯著低于對(duì)照組;PES膜上貼壁細(xì)胞數(shù)明顯較CA和CNA膜多,形態(tài)典型。PES和PSF膜上細(xì)胞DNA總量與對(duì)照組無顯著差異,顯著高于CA、PP、CNA膜,PVDF膜上細(xì)胞DNA總量顯著低于對(duì)照組;在7天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),PES膜上和對(duì)照組的細(xì)胞活性最高,顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜。PES膜上培養(yǎng)L02細(xì)胞合成的細(xì)胞總蛋白與對(duì)照組無顯著差異,顯著

8、高于其它膜材料;各種膜材料上培養(yǎng)L02細(xì)胞CYP1A2活性均高于對(duì)照組。 2.制備的PES平板膜和中空纖維的橫截面由大量縱向排列的指狀孔構(gòu)成,指狀孔開口于外表面形成有大量微孔的粗糙面,封閉于的內(nèi)表面形成致密層和光滑面。PES膜上L02細(xì)胞的生長曲線典型,在8d的培養(yǎng)時(shí)間能增殖6至7倍,中空纖維上培養(yǎng)的L02細(xì)胞可長滿中空纖維表面;細(xì)胞在PES膜和中空纖維上粘附呈多細(xì)胞聚集生長,可覆蓋材料表面,部分細(xì)胞延伸入表面微孔內(nèi)。PES膜和

9、中空纖維上培養(yǎng)細(xì)胞LDH漏出量與對(duì)照無顯著差異。PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細(xì)胞的白蛋白合成量持續(xù)升高,在第8天反超對(duì)照組細(xì)胞;在DiI-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)中,PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度與對(duì)照無明顯差異,在戊醚試鹵靈轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度比對(duì)照組高。 3.制備出高孔隙率和有彈性的聚氨酯多孔支架材料,殼聚糖易塌陷變形,聚乳酸-聚羥乙酸酯質(zhì)地較硬,提示聚氨酯更容易與中空

10、纖維組合。L02細(xì)胞在聚氨酯和殼聚糖支架材料內(nèi)的細(xì)胞接種率顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯,殼聚糖內(nèi)的細(xì)胞接種率最高;L02細(xì)胞在聚氨酯和聚乳酸-聚羥乙酸酯內(nèi)均粘附微孔壁生長,在聚氨酯內(nèi)分布更均勻,在殼聚糖內(nèi)呈多細(xì)胞聚集生長;聚氨酯和殼聚糖內(nèi)培養(yǎng)L02細(xì)胞的活性和白蛋白合成量顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯,聚氨酯和殼聚糖之間無顯著差異。鼠尾膠原被覆組和對(duì)照組的L02細(xì)胞均在聚氨酯材料微孔內(nèi)貼壁生長,鼠尾膠原被覆組的貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯高于聚氨酯對(duì)照組

11、,纖維蛋白凝膠組培養(yǎng)的L02細(xì)胞均勻分布在材料微孔內(nèi),呈多細(xì)胞球形體生長;纖維蛋白凝膠組L02細(xì)胞的活性在7d內(nèi)顯著升高,在3、5、7d均顯著高于聚氨酯對(duì)照組和纖維蛋白凝膠組;纖維蛋白凝膠組L02細(xì)胞的白蛋白合成量逐漸升高,在培養(yǎng)的第5和7d顯著高于鼠尾膠原被覆組和聚氨酯對(duì)照組。 4.以單內(nèi)皮層PES中空纖維和聚氨酯材料為骨架構(gòu)建出雜交型三維立體式生物反應(yīng)器。在物質(zhì)傳輸實(shí)驗(yàn)中,雜交型生物反應(yīng)器內(nèi)外腔總膽紅素和白蛋白濃度達(dá)到平衡分

12、別需10min和15min,與對(duì)照組無明顯差異,凝膠化雜交型反應(yīng)器內(nèi)總膽紅素和白蛋白濃度達(dá)到平衡較對(duì)照組延緩5min,但30min內(nèi)能完全達(dá)到平衡,提示構(gòu)建的反應(yīng)器具有良好的物質(zhì)傳輸能力,凝膠化對(duì)反應(yīng)器物質(zhì)傳輸?shù)臒o顯著影響。凝膠化培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞呈球形體生長,較對(duì)照組分布更均勻;反應(yīng)器凝膠化培養(yǎng)可恢復(fù)肝細(xì)胞CYP3A4和UGT1AmRNA的表達(dá);凝膠化反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的白蛋白合成、尿素合成、氨清除率均持續(xù)穩(wěn)定上升,在培養(yǎng)后期顯著高于對(duì)照

13、組,LDH漏出量較對(duì)照組更低,有較強(qiáng)的CYP1A2活性;凝膠化反應(yīng)器內(nèi)重型肝炎病人血漿循環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)6h的體外循環(huán),病人血漿中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總膽汁酸、氨等的含量均顯著降低。在循環(huán)病人血漿中ALT、ALP、GGT等酶無顯著影響,但AST和LDH持續(xù)升高。 以上結(jié)果提示: ①在PES、PSF、CA、PVDF、PP、CNA等半透膜材料中,PES是肝細(xì)胞相容性最佳的半透膜材料,適宜用于生物反應(yīng)器中空纖維的制

14、備。 ②制備的PES平板膜和中空纖維具備單內(nèi)皮層、指狀孔、外表面粗糙、內(nèi)表面光滑、非對(duì)稱性的特點(diǎn),能夠較好的支持肝細(xì)胞的粘附、生長、增殖和功能的表達(dá)。 ③制備出高孔隙率有彈性的聚氨酯支架材料,與肝細(xì)胞有較好的細(xì)胞相容性,纖維蛋白凝膠能有效優(yōu)化聚氨酯材料內(nèi)肝細(xì)胞培養(yǎng)條件,提高培養(yǎng)肝細(xì)胞活性和功能的穩(wěn)定表達(dá)。 ④成功的構(gòu)建出雜交型三維立體式生物反應(yīng)器,該反應(yīng)器具有良好的物質(zhì)傳輸能力,凝膠化生物反應(yīng)器能夠培養(yǎng)大量、高密

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