AmpG基因多樣性及其功能研究.pdf

1、背景:
　　β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是臨床常用且有效的抗感染藥物，然而由于抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致致病菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重。致病菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的抗性有80％是由于細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶所致。對(duì)于細(xì)菌產(chǎn)誘導(dǎo)型β-內(nèi)酰胺酶研究較多的是AmpC產(chǎn)酶系統(tǒng)，尤其是其調(diào)節(jié)基因ampR，ampD的突變對(duì)產(chǎn)酶系統(tǒng)的影響，而對(duì)于另一種重要的調(diào)節(jié)基因ampG則研究較少。在腸桿菌科中，AmpG蛋白作為膜通道蛋白參與細(xì)胞壁的再生，并且在有β-內(nèi)酰

2、胺類抗菌藥物脅迫的條件下，具有重要的信號(hào)傳導(dǎo)功能，在細(xì)菌產(chǎn)生AmpCβ-內(nèi)酰胺酶過(guò)程中起到重要作用。
　　目的:
　　本文在現(xiàn)有對(duì)AmpG基因研究的基礎(chǔ)上，借助在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到的不同種屬細(xì)菌AmpG基因參考序列，結(jié)合本研究中對(duì)不同來(lái)源AmpG基因的測(cè)序，分析AmpG基因在不同種屬菌株中的多樣性;以缺失AmpG基因后的銅綠假單胞菌為受體，通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，探討不同種屬菌株來(lái)源的AmpG基因?qū)μ请牡霓D(zhuǎn)運(yùn)效率的影響，研究Am

3、pG基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為篩選和合成抑制AmpG功能的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本文搜集并分類整理NCBI的不同種屬細(xì)菌基因組的AmpG基因序列，對(duì)所得基因序列進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)其蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析AmpG基因的多樣性;通過(guò)分子克隆技術(shù)，克隆不同種屬細(xì)菌的AmpG基因;以敲除AmpG基因的銅綠假單胞菌為受體菌，進(jìn)行克隆AmpG基因的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn);，通過(guò)測(cè)定有關(guān)菌株的氨芐抗性水平，分析不同種屬菌株

4、來(lái)源的AmpG基因的轉(zhuǎn)運(yùn)糖肽效率，進(jìn)行AmpG基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。
　　結(jié)果:
　　1、我們?cè)贜CBI中搜集到細(xì)菌AmpG基因序列498條，蛋白序列2156條，分屬不同的種屬，包括大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，陰溝桿菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，霍亂弧菌，假結(jié)核耶爾森菌，流感嗜血桿菌，沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，銅綠假單胞菌，志賀氏菌等多種臨床常見(jiàn)菌種。
　　2、對(duì)以上所提到的十一種菌的AmpG基因序列及蛋白序列進(jìn)行分類整理，并

5、對(duì)其蛋白序列進(jìn)行整合，得到每種菌的蛋白參考序列各一條。并對(duì)參考序列進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這十一種菌的跨膜區(qū)數(shù)都在10到14個(gè)之間，其中大腸桿菌，肺炎克雷伯菌，假結(jié)核耶爾森菌，沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，銅綠假單胞菌，陰溝桿菌，志賀氏菌最多為14個(gè);而流感嗜血桿菌，鮑曼不動(dòng)桿菌較少，分別為12，11個(gè);霍亂弧菌最少，為10個(gè)。
　　3、以銅綠PA01為主要研究對(duì)象，其氨基酸序列分別與其他十種菌的AmpG氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，得到銅綠與

6、其他菌氨基酸相似度分別為沙門83％，志賀80％，大腸80％，陰溝77％，肺克77％，霍亂75％，假結(jié)核71％，鼠疫71％，流感68％，鮑曼64％。
　　4、選擇大腸桿菌，鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌作為供體菌，將其AmpG基因回補(bǔ)至敲除了AmpG基因的銅綠PA01，發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)后的PA01△ampG的Amp-MIC由原來(lái)的32μg/μl回升到了256，128及256μg/μl。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)對(duì)各菌AmpG蛋白序列的分