通過(guò)質(zhì)粒分子育種培育高效降解除草劑阿特拉津的細(xì)菌菌株.pdf

1、阿特拉津(atrazine)，化學(xué)名2-氯--4--乙胺基--6--異丙胺基-1，3，5-三嗪，商品名莠去津，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛使用的三嗪類(lèi)除草劑，主要用于玉米、高粱、柑橘、甘蔗地的雜草防除。近40年來(lái)，由于阿特拉津的大量生產(chǎn)和使用，已經(jīng)造成世界范圍的土壤、地表水和地下水的嚴(yán)重污染。阿特拉津殘留量過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)影響輪作作物的生長(zhǎng)，還會(huì)威脅人體健康。研究表明，阿特拉津是一種內(nèi)分泌干擾劑，它能干擾激素調(diào)節(jié)功能，長(zhǎng)期接觸會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物卵巢

2、癌、乳腺癌和白血病的發(fā)生，引起人和兩棲動(dòng)物的生殖缺陷和體重減輕。因此，阿特拉津的生物降解和污染環(huán)境的生物修復(fù)研究對(duì)生態(tài)安全和人類(lèi)健康具有重要意義。 本研究通過(guò)富集培養(yǎng)從阿特拉津農(nóng)藥廠的廢水和污泥中得到降解阿特拉津的混合菌群，它能以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快，但不能徹底地降解阿特拉津，只能將阿特拉津降解為氰尿酸。我們以模式菌株假單胞菌ADP為供體，與混合菌群共同培養(yǎng)，通過(guò)質(zhì)粒分子育種培育并篩選出兩株高效、快速、徹底降解阿特

3、拉津的菌株，分別命名NAD3和AD25。通過(guò)16S rRNA基因序列分析，它們與Arthrobacter和Micrococcus的同源性都在99％以上，結(jié)合Biolog分類(lèi)鑒定結(jié)果，確定AD3菌株為藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，AD25菌株屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp．)。 AD3和AD25菌株能以蔗糖或檸檬酸鈉為碳源，阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)，降解速率和降解率都大大好于ADP菌株，可以將培養(yǎng)

4、基中500 mg/L的阿特拉津在72 h內(nèi)降解95％以上，并保持菌體較高的生長(zhǎng)量。通過(guò)溫度、pH值和阿特拉津濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)，確定AD3和AD25菌株的最適生長(zhǎng)條件為：阿特拉津濃度為500 mg/L，pH 7．0，30℃。但氰尿酸積累實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD25菌株生長(zhǎng)后期在培養(yǎng)基中有少量氰尿酸積累，而混合菌群在培養(yǎng)基中氰尿酸不斷形成積累。 斑點(diǎn)雜交和PCR分析表明，AD3和AD25菌株基因組中沒(méi)有atzA基因，它們都含有trzN

5、、atzB、atzC和atzDEF基因。AD25菌株中的trzN基因與Arthrobacter aurescens TCl菌株中的trzN基因的同源性為99％，atzB、atzC和atzEF基因與ADP菌株中相應(yīng)的基因同源性為99％-100％。AD25菌株中的atzD基因的全基因序列與ADP菌株中的atzD基因同源性為99％，其中一個(gè)核苷酸發(fā)生了變化，導(dǎo)致編碼的蛋白中一個(gè)氨基酸發(fā)生改變。質(zhì)粒分析發(fā)現(xiàn)，AD25菌株和ADP菌株中含有一個(gè)相

6、同大小的質(zhì)粒，Southern雜交結(jié)果表明，atzD基因位于質(zhì)粒上，說(shuō)明接合體菌株AD25獲得了atzD基因，并且ADP菌株中的阿特拉津降解質(zhì)粒pADP-1接合轉(zhuǎn)移到了AD25菌株中。trzN基因位于細(xì)菌的染色體上。對(duì)AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶AtzD進(jìn)行了表達(dá)純化和酶學(xué)性質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)AD25菌株的AtzD純酶酶反應(yīng)的最適pH為7.8，在pH 7.0和7.4的中性環(huán)境中比較穩(wěn)定，對(duì)37℃的耐受能力較強(qiáng)。Cu<'2+>和Zn<'2+>

7、對(duì)酶有激活作用，F(xiàn)e<'2+>、Ca<'2+>和EDTA對(duì)酶有一定的抑制作用，Mg<'2+>對(duì)酶幾乎沒(méi)有影響，Co<'2+>和Ni<'2+>對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用。AD25菌株的AtzD對(duì)氰尿酸的K<,m>為308.8±20μmol·L<'-1>，V<,max>為49.8±10μmol·L<'-1>min<'-1>，而ADP菌株的AtzD的K<,m>為31.5±10 μmol·L<'-1>，V<,max>為345±10μmol·L<'-1

8、>min<'-1>。AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶的反應(yīng)速度要比ADP菌株的慢十倍，說(shuō)明AD25菌株的AtzD在底物濃度較高時(shí)才能進(jìn)行酶反應(yīng)，酶與底物的結(jié)合能力差，而ADP菌株的氰尿酸酰胺水解酶在底物濃度較低的情況下就可以催化酶反應(yīng)進(jìn)行，酶與底物的結(jié)合能力強(qiáng)，酶反應(yīng)速度快。推測(cè)AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶活力低是由于其基因和酶發(fā)生突變?cè)斐傻摹?用濃度為14％的聚乙烯醇(PVA)包埋的AD3菌株細(xì)胞在阿特拉津含量為500mg/L