NYD-SP5基因在小鼠睪丸中的表達及NYD-SP5干擾載體的構建.pdf

1、目的：基因NYD—SP5是Lan—Lan Yin等在人睪丸cDNA microarray差異雜交的基礎上，克隆的一個新的成人睪丸高度表達的基因。它由3598個核苷酸組成，包括1027個氨基酸開放閱讀框架。序列分析顯示基因NYD—SP5與小鼠睪丸基因AK019535的核苷酸序列及其編碼蛋白BAB31783的氨基酸序列具有很高的同源性。本研究用免疫組化和原位雜交方法研究了基因NYD—SP5在小鼠睪丸組織中的表達及定位；并構建基因NYD—SP

2、5具有發(fā)夾結構小干擾RNA(shRNA)表達質(zhì)粒。為下一步建立基因NYD—SP5的轉(zhuǎn)基因小鼠模型及研究該基因的功能奠定了基礎。 方法：用原位雜交法研究小鼠睪丸組織中NYD—SP5 mRNA的表達及定位；用免疫組化法研究小鼠睪丸組織中NYD—SP5蛋白的表達及定位。構建基因NYD—SP5的4個pGPU6/GFP—shRNA載體。根據(jù)NYD—SP5 mRNA序列，設計有小發(fā)夾結構的4條寡核苷酸序列，克隆到空載體pGPU6/GFP中，

3、構建重組質(zhì)粒，提純及鑒定重組質(zhì)粒，同時設計構建分別針對人GAPDH干擾質(zhì)粒作為陽性對照，不針對任何特異基因的質(zhì)粒作為陰性對照。通過酶切鑒定和測序驗證陽性克隆。 結果：原位雜交技術顯示，在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細胞細胞質(zhì)中實驗組有棕黃色的染色，對照組未見棕黃色染色，說明NYD—SP5 mRNA存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細胞中。免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細胞胞質(zhì)及管腔纖毛中，實驗組有棕黃色染色，對照

4、組未見棕黃色染色，說明NYD—SP5蛋白主要存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細胞及管腔纖毛中。酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實，我們設計的堿基序列成功插入到了預計位點。經(jīng)重組質(zhì)粒篩選，重組質(zhì)粒測序鑒定與設計的shRNA轉(zhuǎn)錄模板序列相同，均證實重組質(zhì)粒構建成功。 結論：小鼠睪丸生精細胞中存在NYD—SP5 mRNA和蛋白表達，提示該基因可能對精子的發(fā)生發(fā)揮作用。利用RNA干擾技術路線可成功構建靶向NYD—SP5的發(fā)夾結構小干