NYD-SP5基因在小鼠睪丸中的表達(dá)及NYD-SP5干擾載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：基因NYD—SP5是Lan—Lan Yin等在人睪丸cDNA microarray差異雜交的基礎(chǔ)上，克隆的一個(gè)新的成人睪丸高度表達(dá)的基因。它由3598個(gè)核苷酸組成，包括1027個(gè)氨基酸開放閱讀框架。序列分析顯示基因NYD—SP5與小鼠睪丸基因AK019535的核苷酸序列及其編碼蛋白BAB31783的氨基酸序列具有很高的同源性。本研究用免疫組化和原位雜交方法研究了基因NYD—SP5在小鼠睪丸組織中的表達(dá)及定位；并構(gòu)建基因NYD—SP

2、5具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA(shRNA)表達(dá)質(zhì)粒。為下一步建立基因NYD—SP5的轉(zhuǎn)基因小鼠模型及研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 方法：用原位雜交法研究小鼠睪丸組織中NYD—SP5 mRNA的表達(dá)及定位；用免疫組化法研究小鼠睪丸組織中NYD—SP5蛋白的表達(dá)及定位。構(gòu)建基因NYD—SP5的4個(gè)pGPU6/GFP—shRNA載體。根據(jù)NYD—SP5 mRNA序列，設(shè)計(jì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的4條寡核苷酸序列，克隆到空載體pGPU6/GFP中，

3、構(gòu)建重組質(zhì)粒，提純及鑒定重組質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建分別針對(duì)人GAPDH干擾質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，不針對(duì)任何特異基因的質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。通過酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆。 結(jié)果：原位雜交技術(shù)顯示，在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中實(shí)驗(yàn)組有棕黃色的染色，對(duì)照組未見棕黃色染色，說明NYD—SP5 mRNA存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞中。免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞胞質(zhì)及管腔纖毛中，實(shí)驗(yàn)組有棕黃色染色，對(duì)照

4、組未見棕黃色染色，說明NYD—SP5蛋白主要存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞及管腔纖毛中。酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)的堿基序列成功插入到了預(yù)計(jì)位點(diǎn)。經(jīng)重組質(zhì)粒篩選，重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定與設(shè)計(jì)的shRNA轉(zhuǎn)錄模板序列相同，均證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 結(jié)論：小鼠睪丸生精細(xì)胞中存在NYD—SP5 mRNA和蛋白表達(dá)，提示該基因可能對(duì)精子的發(fā)生發(fā)揮作用。利用RNA干擾技術(shù)路線可成功構(gòu)建靶向NYD—SP5的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干