硫酸二甲酯處理叢枝病泡桐幼苗miRNA變化研究.pdf

1、泡桐叢枝病是由植原體引起的一種傳染性病害，不僅給泡桐生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且也嚴(yán)重影響人們種植泡桐的積極性。泡桐叢枝病是我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題之一，在過(guò)去的40多年中，科研工作者對(duì)泡桐叢枝病和植原體兩方面進(jìn)行了研究，首先，科研人員進(jìn)行大量的生理生化及相關(guān)基因表達(dá)的研究，對(duì)叢枝病植原體也開展了病原的傳播途徑，分類，繁殖方式等研究工作，但是叢枝病的發(fā)病機(jī)理仍不清楚。在本研究中，以白花泡桐、毛泡桐以及雜交種豫雜一號(hào)泡桐的健康苗、叢枝

2、病苗和用15mg·L-1硫酸二甲酯(Dimethyl sulphonate，DMS)甲基劑處理的病苗為實(shí)驗(yàn)材料，成功的構(gòu)建了9個(gè)sRNA文庫(kù)(PF、PFI、PFI-D15、PT、PTI、PTI-D15、PTF、PTFI、PTFI-D15)并進(jìn)行了測(cè)序分析。在觀察幼苗形態(tài)變化的同時(shí)，從分子生物學(xué)水平研究了植原體侵入對(duì)白花泡桐，豫雜一號(hào)泡桐和毛泡桐基因表達(dá)的影響。現(xiàn)將結(jié)果歸納如下:
　　(1)對(duì)3個(gè)種泡桐的9個(gè)sRNA文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序，

3、每個(gè)樣品均測(cè)到近1千萬(wàn)條raw reads序列。利用生物信息學(xué)軟件分析后，然后分別得到Valid reads(PF)11378626條，(PFI)10311261條，(PFI-D15)7447741條，(PI)7283265條，(PTI)8660319條，(PTI-D15)6784031條，(PTF)10376326條，(PTFI)6791333條，和(PTFI-D15)7698718條泡桐基因組序列。
　　(2)對(duì)9個(gè)泡桐基因組

4、文庫(kù)進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，將sRNA序列比對(duì)到泡桐基因組上，全面系統(tǒng)地比較了各個(gè)類型sRNA序列的種類和數(shù)量，共獲得到了519個(gè)mRNA。其中，白花泡桐共鑒定出206個(gè)保守miRNAs和122個(gè)新型miRNAs;毛泡桐共鑒定出295個(gè)保守miRNAs和156個(gè)新型miRNAs;豫雜一號(hào)泡桐共鑒定出291個(gè)保守miRNAs和140個(gè)新型miRNAs。
　　(3)由比對(duì)方案挑出3個(gè)泡桐種共有表達(dá)差異mRNAs27條（保守mi

5、RNAs和新型miRNAs序列分別為23條和4條）。白花泡桐和毛泡桐共有差異miRNAs序列56條（46條保守miRNAs和10條新型miRNAs），雜交種豫雜一號(hào)泡桐鑒定的miRNA數(shù)量和成員與其親本有所不同，豫雜一號(hào)泡桐和父本白花泡桐共有差異miRNAs51條（保守miRNAs40條和新型miRNAs11條），與母本毛泡桐共有差異miRNAs106條（保守miRNAs85條和新型miRNAs21條）。通過(guò)對(duì)比這3個(gè)種之間獲得的差異m

6、iRNA靶基因的功能，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)種間共有的27個(gè)miRNA在叢枝病發(fā)生過(guò)程中起重要作用。
　　(4)利用降解組測(cè)序技術(shù)對(duì)3個(gè)種泡桐的miRNA進(jìn)行了靶基因的鑒定和分析。此外，對(duì)差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行了GO功能注釋分類和KEGG代謝途徑富集分析。發(fā)現(xiàn)與植原體脅迫及其形態(tài)變化相關(guān)的miRNA的靶基因的功能主要涉及其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites

7、)、其他氨基酸代謝(Metabolism of other amino acids)、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡Cell growth and death)、免疫系統(tǒng)(Immune system)、外源物質(zhì)的生物降解和代謝(Xenobiotics biodegradation and metabolism)等代謝途徑。
　　(5)從這些差異miRNA及其靶基因中，挑出7個(gè)差異miRNAs和4個(gè)靶基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示qPCR的結(jié)果與測(cè)