VEGF，VEGFR-3，Ang-2，ES與喉鱗癌轉移的相關性研究.pdf

1、目的：頭頸腫瘤也同其它大多數(shù)實體腫瘤一樣，瘤體內(nèi)的部分細胞處于缺氧環(huán)境之中。腫瘤持續(xù)性生長和轉移需要有新生血管的形成，以新生血管為靶點對腫瘤進行生物學治療已成為近幾年新的研究熱點。本實驗主要是研究喉鱗癌大體臨床標本及簡單模擬實體瘤內(nèi)部常氧和低氧條件（Hypoxia Inducible Factor1 alpha，HIF-1α）下與血管生成相關的四個指標（vascular endothelial growth factor，VEGF；va

2、scular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3；angiopoietin2，Ang-2； endostatin，ES）的表達，探討各個蛋白在喉鱗癌轉移過程中的確切作用。為頭頸腫瘤的治療奠定實驗基礎。
　　 方法：
　　 1.將所有大體臨床標本經(jīng)4％中性甲醛液固定，石蠟包埋，5μ m連續(xù)切片，利用免疫組織化學PV（Polymer Conjugated）法即用型二步法（非

3、生物素）檢測法，檢測HIF-1α、VEGF、 VEGFR-3、Ang-2和ES的表達。
　　 2.人喉鱗癌（Hep-2）細胞培養(yǎng)于含10％新生小牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100μg/ml）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)，置于37℃，5％CO2，20％O2（常氧）或37℃，5％CO2，2％O2，94％N2（低氧）的培養(yǎng)箱中。待細胞進入對數(shù)生長期后，將細胞分為2組：A組（常氧24h組）、B組（低氧24h組

4、）。收集各組細胞。流式細胞儀檢測HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ES蛋白表達；細胞爬片免疫組化檢測各組細胞HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ES蛋白表達；RT-PCR檢測各組細胞HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ESmRNA。
　　 結果：
　　 1.免疫組織化學結果：喉鱗癌大體標本中HIF-1α陽性顆粒呈棕黃色，主要定位于癌灶腫瘤細胞胞漿和或胞核中，與癌旁正常組織

5、比較有顯著性差異（t=14.3932，P<0.01），病理分化程度比較及有無淋巴結轉移比較差異有顯著性（p<0.01）。VEGF、VEGFR-3陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞的細胞漿和或胞核中，表達顯著高于癌旁正常組織（VEGF t=4.736 p<0.01；VEGFR-3 t=6.561 P<0.01），病理分化程度比較差異無顯著性（p>0.05），而有無淋巴結轉移比較差異有顯著性（p<0.05）。Ang-2陽性顆粒呈棕黃色，主要定位于癌

6、灶邊緣的腫瘤細胞胞漿，少量血管內(nèi)皮細胞也可見呈微弱表達，顯著高于癌旁正常組織（t=3.474，P<0.01），病理分化程度及有無淋巴結轉移比較均無顯著差異（p>0.05）。ES陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞的細胞漿中，顯著高于癌旁正常組織（t=7.263 p<0.01），病理分化程度比較差異有顯著性（p<0.05），有無淋巴結轉移組比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 2.免疫細胞化學結果：HIF-1α蛋白主要位于胞漿，胞核內(nèi)亦

7、可見其表達，呈棕黃色，且低氧24h組高于常氧24h組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩組細胞中VEGF蛋白均未著色。VEGFR-3、Ang-2蛋白為胞質內(nèi)棕黃色粗細不均勻顆粒，核周表達最為明顯，其中低氧24h組表達明顯高于常氧24h組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ES蛋白為胞質內(nèi)棕黃色粗細不均勻顆粒，核周表達最為明顯，其中常氧24h組表達明顯高于低氧24h組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0·05）。
　　 3.流式細胞化學結

8、果：HIF-1α、VEGF、VEGFR-3和Ang-2蛋白在常氧24h組（HIF-1α1.35±0.05；VEGF1.09±0.03；VEGFR-31.22±0.03；Ang-21.20±0.12）的表達量均明顯低于低氧24h組（HIF-1α1.53±0.06；VEGF1.39±0.07；VEGFR-31.93±0.14；Ang-22.04±0.09）且P<0.05差異有統(tǒng)計學意義；ES蛋白在常氧24h組（1.69±0.01）的表達量明

9、顯高于低氧24h組（1.07±0.19）且P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　 4.RT-PCR結果：HIF-1α、VEGF、VEGFR-3和Ang-2mRNA在常氧24h組（HIF-1α1.33±0.10；VEGF0.94±0.02；VEGFR-30.53±0.02；Ang-20.32±0.02）的表達量明顯低于低氧24h組（HIF-1α1.74±0.13；VEGF1.00±0.02；VEGFR-30.62±0.03；Ang-

10、20.434-0.01）且P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。ES mRNA在顯示常氧24h組（0.49±0.02）的表達量明顯高于低氧24h組（0.38±0.02）且P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5.Pearson積差相關性分析顯示：喉鱗癌臨床組織中HIF-1α的表達與VEGF的表達呈正相關（r=0.8679，P<0.01），與Ang-2的表達呈正相關（r=0.058，P>0.05），與ES的表達呈負相關（r=-0.268

11、P>0.05）； VEGF與VEGFR-3的表達呈高度正相關（r=0.7365，P<0.01），與ES的表達呈負相關（r=-0.202 P>0.05）；Ang-2的表達與VEGF的表達呈高度正相關（r=0.8193，P<0.01），與ES的表達呈正相關（r=0.38P<0.05）。
　　 結論：
　　 1.低氧能明顯促進腫瘤細胞HIF-1α蛋白的表達，且這一作用發(fā)生在mRNA水平；
　　 2.HIF-1α蛋白表達