2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、中心體是參與細胞有絲分裂的重要細胞器,是動物細胞中主要的微管組織中心,它影響了細胞內(nèi)所有與微管相關的過程,它與雙極紡錘體的形成、紡錘體的定位和胞質(zhì)分裂直接相關.紡錘體數(shù)目的異常直接干擾了雙極紡錘體的形成以及染色體的分離過程.因此在分裂細胞中,中心體的復制和分離必須與染色體的復制和分離過程相協(xié)調(diào).在特定的細胞周期中,中心體只能分裂一次,中心體數(shù)目過多會導致多極紡錘體形成,出現(xiàn)錯誤的有絲分裂過程,從而直接導致染色體非整倍性的發(fā)生,染色體的不

2、穩(wěn)定性通常認為是引起腫瘤發(fā)生的主要機制.中心體上結(jié)合的蛋白超過一百種,75﹪具有coiled-coil結(jié)構(gòu)域,至今仍有許多中心體蛋白質(zhì)尚未被發(fā)現(xiàn),它們的功能也不完全清楚.中心體蛋白質(zhì)中有不少是重要的有絲分裂激酶,與細胞周期和調(diào)定點調(diào)控高度相關.目前公認的有絲分裂調(diào)控蛋白主要有CdK家族,Polo家族,Aurora家族,NIMA家族,TTK,Cep55,Bubl,BubRl等.PLK1 (Polo-like Kinase 1)就是在脊椎動

3、物中的一種PLK,隸屬于Polo家族,是一種與細胞有絲分裂高度相關的激酶.PLK1可以特異性地磷酸化蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸,它通過磷酸化它的下游底物來放大調(diào)節(jié)它們的功能活性.PLK1蛋白質(zhì)與PLK的其它蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上可以分為兩部分:N端的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain) 和C端的Polo盒結(jié)構(gòu)域(PBD,polo-box domain),PLK1通過PBD與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用.它在進化中表現(xiàn)得相當保守,從酵母、果蠅、爪蟾到哺

4、乳動物都有它的同源物.如果PLK1被敲除后會引起單級紡錘體,染色體排列異常,有絲分裂阻斷等表型.另外PLK1在DNA損傷和調(diào)節(jié)細胞周期的各調(diào)定點也至關重要. 本課題組在前一階段的工作中利用端粒結(jié)合蛋白TRF1特異性抗體,通過免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)肽指紋譜技術(shù)從分裂期細胞裂解液中分離鑒定了一個TRF1新的相互作用中心體蛋白,將該蛋白命名為TACP1(Te1omere Associated CentrosomeProtein 1).本

5、研究是在此基礎上對TACP1這個新的中心體蛋白功能展開,以期完善中心體蛋白網(wǎng)絡中新蛋白TACP1的分子機制.本研究分為兩個部分. 第一部分:中心體蛋白TACP1與有絲分裂激酶PLK1相互作用和磷酸化調(diào)控的研究.本研究發(fā)現(xiàn)TACP1在細胞有絲分裂期能發(fā)生特異性磷酸化,通過免疫共沉淀后用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Thr221、Thr457是它的潛在磷酸化位點,而它們的磷酸化激酶可能分別是Nek2A和PLK1.隨即通過免疫共沉淀和pull-dow

6、n實驗證實TACP1在體內(nèi)、體外都能與PLK1形成復合物即兩者之間存在相互作用,免疫熒光實驗結(jié)果也顯示它們在有絲分裂期共同定位于中心體.生化實驗結(jié)果還提示PLK1與FACP1結(jié)合依賴于TACP1的羧基端.TACP1-C是PLK1的結(jié)合功能區(qū),PLK1與TACP1結(jié)合并不依賴于TACP1的中心體定位功能域(TACP1-MC).PLK1可以在體外條件下特異性磷酸化野生型TACP1,該實驗還證實了PLK1激酶活性缺失型則無法磷酸化TACP1,

7、模擬非磷酸化狀態(tài)的TACP1457A突變型也無法被PLK1磷酸化,從而證實PLK1的確是TACP1蛋白457位蘇氨酸的磷酸化激酶.當siRNA基因抑制內(nèi)源性的PLK1后,TACP1穩(wěn)定表達的He1a細胞G2/M期的細胞明顯增多.我們推測TACP1得不到PLK1的磷酸化,過量非磷酸化的TACP1蛋白造成細胞無法通過G2/M調(diào)定點從而造成阻滯.為了深入探討TACP1被P1K1磷酸化發(fā)生的時間空間信息,利用針對TACP1的457位蘇氨酸磷酸化

8、抗體進行免疫熒光實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1磷酸化TACP1發(fā)生于有絲分裂前期、前中期、中期,空間上位于中心體上.后期開始以后,TACP1在中心體上的信號就開始彌散削弱,末期時完全消失.siRNA基因干擾抑制P1K1表達導致TACP1無法定位于中心體,但如果僅抑制P1K1激酶活性,TACP1仍定位于中心體,因此TACP1的中心體定位依賴于PLK1而非PLK1的磷酸化作用. 第二部分:TACP1對中心體功能的調(diào)控.為了探討TACP1的功

9、能,篩選建立了TACP1穩(wěn)定表達的Hela細胞株.在此細胞株上進行免疫熒光實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TACP1在細胞周期中的定位呈現(xiàn)出動態(tài)性,間期分布于胞質(zhì),部分共定位于F-actin,有絲分裂期則定位于中心體上.本研究主要立足于探討TACP1在有絲分裂期的功能研究.利用互聯(lián)網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫,通過蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn)TACP1與裂殖酵母中心體蛋白Pcp1同源.若用TACP1 siRNA干擾抑制內(nèi)源性RACP1蛋白表達后,免疫熒光實驗結(jié)果顯示染色體異常排列

10、的細胞明顯增多:滯后染色體以及染色體排列紊亂等,并出現(xiàn)多中心體表型,計數(shù)這些異常表型的細胞,數(shù)量明顯高于對照組. 本研究運用分子生物學、細胞生物學和蛋白質(zhì)組學的方法來研究有絲分裂激酶PLKl對中心體蛋白TACP1的磷酸化修飾,TACP1磷酸化的功能,TAC1在中心體上的細胞生物學作用,從而闡明TACP1參與的細胞周期調(diào)控信號通路和分子機制.獲得以下結(jié)果①TACP1在細胞有絲分裂期能發(fā)生特異性磷酸化,Thr221、Thr457是

11、它的潛在磷酸化位點,而它們的磷酸化激酶可能分別是Nek2A和PLK1.⑦體外的蛋白Pull-down實驗和體內(nèi)的免疫共沉淀實驗證實TACPl在體內(nèi)、體外都能與PLK1相互作用,免疫熒光實驗結(jié)果顯示它們在有絲分裂期共同定位于中心體.④證明了PLK1與TACP1結(jié)合依賴于TACP1的羧基端.④PLK1可以在體外的條件下特異性磷酸化野生型TACP1,而PLKlKD(激酶活性缺失型)則無法磷酸化TACP1,模擬非磷酸化狀態(tài)的TACP1457A突

12、變型也無法被PLK1磷酸化.表明PLK1的確是TACP1蛋白457位蘇氨酸的磷酸化激酶.⑤過量表達的TACP1得不到PLK1的磷酸化,大量非磷酸化的TACP1蛋白會使細胞阻滯在G2/M期.⑥PLK1磷酸化TACP1時間上發(fā)生于有絲分裂前期、前中期、中期,空間上位于中心體上.⑦TACPl定位于中心體依賴于PLK1而非PLK1的磷酸化作用⑧TACPl在細胞周期中的定位呈現(xiàn)出動態(tài)性,間期分布于胞質(zhì)一部分與F-actin共定位,有絲分裂期則定位

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