STK15通過IkB磷酸化調(diào)節(jié)CDK2基因表達與喉癌中心體擴增研究.pdf

1、前言：喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。在我國,東北地區(qū)是喉癌的高發(fā)地區(qū)。過去的10年中,我國喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。喉癌對放療及化療均不敏感,手術(shù)是目前治療的主要手段,但手術(shù)會給患者造成不同程度的損傷。目前,喉癌的發(fā)生機制尚不明確,探索喉癌發(fā)生機制,將有助于從根本上解決喉癌防治的關(guān)鍵問題,因此,發(fā)現(xiàn)喉癌發(fā)生相關(guān)基因、探索喉癌發(fā)生機制已經(jīng)成為喉癌研

2、究的熱點問題。
　　 染色體異常被認為是腫瘤細胞的特征性改變,而細胞有絲分裂異常常可以引起染色體不穩(wěn)定。中心體作為細胞的主要微管組織中心,在細胞周期過程中建立兩極紡錘體,調(diào)節(jié)細胞有絲分裂,對維持細胞的染色體穩(wěn)定起著重要的作用。因此腫瘤細胞中的染色體異?？赡芘c中心體的異常密切相關(guān)?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤細胞中存在多種中心體異常,而中心體擴增是常見異常之一。STK15、CDK2基因是與中心體密切相關(guān)的基因,STK15、CDK2基因的異常

3、表達可以引起中心體擴增,導致染色體不穩(wěn)定,從而引起細胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)STK15在喉癌組織中存在mRNA高表達,并檢測到喉癌組織原代培養(yǎng)細胞中心體擴增,近期有報道指出STK15能夠通過IkB磷酸化激活NF-kB,另有報道指出在喉癌組織中NF-kB信號通路被激活,在前期工作中我們利用軟件預(yù)測到CDK2啟動子區(qū)存在4個NF-kB潛在結(jié)合位點,提示STK15可能通過NF-kB途徑調(diào)控CDK2表達,進而促進中心體擴增。本研

4、究中,我們利用RT-PCR和Western blot方法檢測STK15、CDK2基因在喉癌組織中的表達,利用表達載體和干擾載體上調(diào)或下調(diào)STK15基因表達,檢測其對CDK2基因表達的影響。利用NF-kB抑制劑和過表達質(zhì)粒改變NF-kB信號通路,檢測NF-kB對CDK2表達和中心體的影響。根據(jù)以上結(jié)果,我們進一步通過熒光素酶報告基因分析、凝膠遷移阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

5、、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP),深入探討STK15通過NF-kB調(diào)節(jié)CDK2表達和中心體擴增的機制,為從中心體擴增角度研究喉癌的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1.喉癌腫瘤及癌旁對照組織,人喉癌細胞系Hep-2,人胚腎細胞系HEK293。
　　 2.RT-PCR及Western blot實驗相關(guān)試劑。
　　 3.免疫熒光相關(guān)試劑。
　　 4.重組質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)試劑

6、。
　　 5.螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑。
　　 6.電泳泳動遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑。
　　 二、實驗方法
　　 1.以臨床喉癌標本和喉癌Hep-2細胞系、人胚腎細胞HEK293細胞系為實驗材料,應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測喉癌組織和細胞中STK15、CDK2基因的表達情況。
　　 2.以HEK293細胞為對照,應(yīng)用免疫熒光方法檢測Hep-2細

7、胞中中心體擴增。
　　 3.應(yīng)用STK15表達載體和針對STK15基因的shRNA干擾載體改變STK15表達水平,檢測其對IkB磷酸化和CDK2表達的影響。
　　 4.利用IkB磷酸化抑制劑BAY11-7082抑制NF-kB通路,利用NF-KB表達載體增強NF-kB表達,研究NF-kB對CDK2表達和中心體擴增的影響。
　　 5.應(yīng)用軟件分析CDK2啟動子結(jié)構(gòu);并構(gòu)建系列截短的CDK2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒,

8、應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)分析各段啟動子的活性。
　　 6.EMSA方法體外鑒定CDK2啟動子區(qū)NF-kB反應(yīng)元件;ChIP實驗進一步在體內(nèi)條件下檢測NF-kB與該位點的結(jié)合作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,人喉癌組織中STK15、CDK2 mRNA和蛋白表達水平均高于癌旁對照組織。
　　 2.喉癌Hep-2細胞中發(fā)現(xiàn)了明顯的中心體擴增,發(fā)生中心體擴增的細胞數(shù)占細

9、胞總數(shù)7～12％,明顯高于HEK293細胞。
　　 3.STK15過表達能夠促進IkB磷酸化,增強CDK2基因表達。靶向STK15的RNA干擾作用能夠降低IkB磷酸化水平,降低CDK2表達。
　　 4.IkB磷酸化抑制劑BAY11-7082能夠降低CDK2表達,抑制喉癌細胞中心體擴增。外源NF-kB能夠促進HEK293細胞CDK2表達,促進中心體擴增。
　　 5.熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示位于CDK2啟動子區(qū)-

10、1010至-1001的潛在NF-kB結(jié)合元件對于NF-kB誘導的CDK2轉(zhuǎn)錄激活有重要意義。
　　 6.EMSA實驗在體外條件下證明了CDK2啟動子-1010至-1001區(qū)為NF-kB反應(yīng)元件;ChIP實驗進一步在體內(nèi)條件下獲得了相同的結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1.與癌旁正常組織相比較STK15、CDK2基因在喉癌組織中高表達,揭示其可能參與喉癌中心體擴增和喉癌發(fā)生發(fā)展。
　　 2.喉癌細胞中中心體擴增