棉花體胚同步發(fā)生及相關(guān)基因表達(dá)和蛋白磷酸化分析.pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞向胚胎發(fā)生途徑轉(zhuǎn)變的發(fā)育再建過程，也是植物全能性預(yù)言的最好說明。體細(xì)胞胚發(fā)生現(xiàn)象被看作是開展生物學(xué)理論研究的良好模型。研究棉花體細(xì)胞胚發(fā)生對(duì)于闡明植物發(fā)育的分子機(jī)理，促進(jìn)作物的遺傳工程改良，無(wú)論在基礎(chǔ)理論還是在實(shí)際應(yīng)用價(jià)值上都具有極其重要的意義。以陸地棉品種Coker201為材料，對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的同步控制技術(shù)、組織細(xì)胞學(xué)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化、酪蛋白激酶活性以及蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)等進(jìn)行了研究。研究結(jié)果

2、如下： 1.棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率低，且體細(xì)胞胚的發(fā)育存在著不同步性，給體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程的生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究帶來(lái)許多困難。以陸地棉品種Coker201為材料，首先篩選了適合體細(xì)胞胚胎發(fā)育的培養(yǎng)基配方，然后以此培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，建立了一種簡(jiǎn)單有效的棉花體細(xì)胞胚高頻率發(fā)生和同步發(fā)育的培養(yǎng)體系。經(jīng)過多次繼代獲得的胚性愈傷首先在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)2d使其分散，然后過30目篩去除大的顆粒，重新懸浮于同樣的液體培

3、養(yǎng)基中。懸浮培養(yǎng)14d后，過50目篩，將篩上的胚性愈傷重懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中，并用吸管吸取懸浮液，將其均勻地接種在表面墊有濾紙的同成分固體培養(yǎng)基(附加2.46μmolL-1IBA和0.70μmolL-1kinetin)上。培養(yǎng)21d后，用摯有濾紙的相同的固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。利用這種培養(yǎng)體系，獲得的體細(xì)胞胚數(shù)量分別是單純懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)(不墊濾紙)的16.5倍和4倍。其中，球形胚、魚雷形胚和子葉胚的同步發(fā)生率分別為70.2％、52.3％

4、和73.0％。 2.以陸地棉品種Coker201下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并以介于30-50目篩之間的胚性愈傷細(xì)胞團(tuán)為材料進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)，采用石蠟切片法觀察棉花愈傷組織誘導(dǎo)和分化過程及體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育過程。結(jié)果顯示棉花胚性愈傷組織有下胚軸兩端發(fā)生、內(nèi)發(fā)生、非胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化、外發(fā)生和腺體處發(fā)生5種形成途徑，其中兩端發(fā)生和內(nèi)發(fā)生是主要的形成方式，都是由下胚軸形成層細(xì)胞直接分化產(chǎn)生；棉花體細(xì)胞胚存在單細(xì)胞起源，多為表面發(fā)生，少量

5、為內(nèi)發(fā)生，并經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚4個(gè)過程，與合子胚形成過程相似。棉花體細(xì)胞胚發(fā)育過程中最關(guān)鍵的事件似乎是極性的建立、頂端分生組織的形成以及前形成層的分化和生長(zhǎng)軸變化。球形胚時(shí)期表皮原層的分化標(biāo)志著體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)分化的開始。初始前形成層的形成是體細(xì)胞胚形態(tài)轉(zhuǎn)變的第一個(gè)信號(hào)。球形胚內(nèi)部等徑細(xì)胞軸向延長(zhǎng)，接著前形成層生長(zhǎng)軸發(fā)生變化，這些是心形胚或橢圓形體胚中的重要事件。魚雷形胚基本分生組織中液泡的出現(xiàn)開始了組織分化的過程。三種主

6、要的胚性組織系統(tǒng)包括芽頂端分生組織，根頂端分生組織和原形成層束在魚雷形胚階段清晰可見。隨后魚雷形胚上層分化形成芽原基和兩個(gè)葉原基。子葉胚的維管組織從兩片子葉伸向胚根，呈V形或Y形。對(duì)一些停滯發(fā)育的球形胚和魚雷形胚的解剖檢查表明，極性建立可能是決定體細(xì)胞胚能否萌發(fā)的關(guān)鍵因素。 3.在體細(xì)胞胚胎發(fā)生和合子胚發(fā)育的過程中，無(wú)論是胚胎發(fā)生的啟動(dòng)還是胚狀體的形態(tài)建成都受到多種因子的調(diào)控，體細(xì)胞胚發(fā)生是一個(gè)由多種基因參與的復(fù)雜時(shí)空調(diào)節(jié)的發(fā)育

7、途徑。本研究從基因表達(dá)水平上對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中所涉及的基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后與翻譯后修飾以及糖類、脂類及氨基酸與蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等生化進(jìn)程進(jìn)行了一定的分析。在所研究的33個(gè)基因中，有25個(gè)來(lái)自一個(gè)棉花的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的SSH文庫(kù)，這些基因在棉花胚性愈傷和各時(shí)期胚狀體中有差異表達(dá)，另外5個(gè)SERK基因和3個(gè)CKII基因來(lái)源于相關(guān)Genebank庫(kù)。根據(jù)qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按目的基因的表達(dá)最高峰所對(duì)應(yīng)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生階段可將這些基

8、因分為3類：(1)與體細(xì)胞胚起始發(fā)生與形態(tài)建成相關(guān)。供試的基因中幾乎所有涉及代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的基因均在這一階段出現(xiàn)表達(dá)高峰，這與前人研究中體細(xì)胞胚發(fā)生過程中DNA含量明顯增加，RNA合成速率明顯提高，mRNA種類豐富，氨基酸含量升高，蛋白質(zhì)合成活躍的特征是不謀而合的，高水平的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白更是成為體細(xì)胞胚發(fā)生的分子標(biāo)記物質(zhì)；后轉(zhuǎn)錄因子在體細(xì)胞胚的形成與發(fā)育階段的高表達(dá)預(yù)示著其生命過程的復(fù)雜性。(2)與體細(xì)胞胚發(fā)育與成熟相關(guān)。從供試的基因表達(dá)高峰

9、所對(duì)應(yīng)的胚胎發(fā)育階段來(lái)看，體胚與合子胚的發(fā)育成熟過程中對(duì)后轉(zhuǎn)錄因子、CKII、腺嘌呤、氨基酸與類脂物質(zhì)代謝相關(guān)的基因需求量是不一致的。體細(xì)胞胚胎發(fā)育與成熟要求較高水平的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白基因、腺嘌呤與氨基酸代謝相關(guān)基因與CKII基因；以SERK為代表的翻譯后修飾基因在體細(xì)胞胚發(fā)育階段的高表達(dá)被認(rèn)為是復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)志，證明了體細(xì)胞胚的發(fā)育和成熟與起始發(fā)生和形態(tài)建成一樣是相當(dāng)復(fù)雜的。(3)與合子胚發(fā)育相關(guān)。合子胚的發(fā)育和成熟要求更高水

10、平的?；D(zhuǎn)移酶；除ERT和SCL轉(zhuǎn)錄因子是體細(xì)胞胚胎發(fā)育所特有的，其余轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平在兩種類型的胚胎發(fā)育過程中沒有明顯特異之處。這可能與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域所能識(shí)別的順勢(shì)因子的差異有關(guān)。本研究結(jié)果首次證實(shí)了HMG轉(zhuǎn)錄因子和GRP蛋白在植物體細(xì)胞胚和合子胚發(fā)生發(fā)育中及CKII在植物體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育中的重要作用。APRT編碼基因在體細(xì)胞胚發(fā)育過程中的活躍表達(dá)，意味著在高等植物胚胎發(fā)生或發(fā)育過程中存在核苷酸補(bǔ)救合成途徑。本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)

11、編碼氧化還原酶的基因在胚性愈傷組織中表達(dá)極度活躍，可能是該階段的標(biāo)記基因。 4.蛋白激酶和磷酸酶主要參與通過蛋白磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)的幾個(gè)細(xì)胞事件。這些事件包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞代謝。CKI和CKII參與了幾種底物的磷酸化。在棉花體細(xì)胞胚發(fā)生過程中研究了蛋白質(zhì)的磷酸化和酪蛋白激酶活性。在測(cè)試的體細(xì)胞胚發(fā)生的5個(gè)階段(非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織、球形胚、魚雷胚和子葉成熟胚)觀察到許多不同的多肽被磷酸化。外源ATP增強(qiáng)了體細(xì)胞胚

12、發(fā)生各階段的蛋白磷酸化作用。岡田酸和礬酸鹽在磷酸化反應(yīng)中的使用增加了蛋白磷酸化水平，這暗示除酪氨酸磷酸酶外，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程各階段還存在絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。實(shí)驗(yàn)中采用CKII抑制劑和膠內(nèi)激酶分析所得結(jié)果表明，體細(xì)胞胚中存在CKII。 5.棉花愈傷組織和體細(xì)胞胚中富含多糖、多酚化合物、脂質(zhì)、色素和其他干擾物質(zhì)，因而采用常規(guī)方法難以制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品。對(duì)陸地棉品種Coker201的胚性培養(yǎng)物，通過添加PVPP研磨和丙酮、TC

13、A/丙酮、甲醇/醋酸銨等有機(jī)溶劑的系列洗滌，然后再進(jìn)行酚抽提，蛋白質(zhì)質(zhì)量得到顯著改善，獲得的2-DE圖譜質(zhì)量高、可分辯的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多。比較分析3種裂解液對(duì)蛋白質(zhì)的溶解效果發(fā)現(xiàn)，在裂解液中混合采用7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲以及4％CHAPS是有效的。對(duì)3種考馬斯亮藍(lán)染色方法和4種銀染色方法分別進(jìn)行比較分析，認(rèn)為由Neuhoff法改進(jìn)而來(lái)的Bluesilver法敏感性比其他考染方法好，穩(wěn)定性也好；銀染色靈敏度高于考馬斯亮藍(lán)染