NGF及CGRP對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CREB表達(dá)和tau蛋白磷酸化的影響.pdf

1、本文研究目的：NGF及CGRP對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CREB表達(dá)和tau蛋白磷酸化的影響。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組。健康雄性Wistar大鼠146只，隨機(jī)分為5組：(1)假手術(shù)對(duì)照組(Sham組，n=31)；(2)缺血再灌注模型組(I/R組，n=31)；(3)NGF處理組(n=28)；(4)CGRP處理組(n=28)；(5)NGF&CGRP合用組(n=28)。各組又分假手術(shù)后或再灌注3h、12h、24h、4

2、8h、72h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。 2、局灶性腦缺血再灌注模型的制備。采用線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制作腦缺血再灌注模型，動(dòng)物清醒后按Longa法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，本研究選取1、2、3分者作為成功模型。缺血2小時(shí)后輕輕拔出栓線以實(shí)現(xiàn)再灌注。I/R組、NGF組、CGRP組、NGF＆CGRP組在再灌注同時(shí)用微量注射泵從右頸總動(dòng)脈分別注入1ml的生理鹽水、NGF(1000U/Kg，)、CGRP(3μg/kg)、NGF＆CGRP(NGF，10

3、00u/kg；CGRP 3μg/kg)，：速度2 ml/h。 3、TTC染色假手術(shù)組與I/R組大鼠于24 h時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)各取3只，斷頭取腦作冠狀切片，放于TTC溶液中染色，后固定，拍照。 4、組織切片的準(zhǔn)備以上各組動(dòng)物分別于再灌注不同時(shí)間點(diǎn)，用多聚甲醛灌注固定，取腦，作連續(xù)腦冠狀冰凍切片。 5、HIE染色觀察海馬組織病理學(xué)變化大鼠腦切片行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察比較各組大鼠再灌注24 h的海馬組織病理學(xué)變化。

4、 6、Nissl染色，計(jì)數(shù)右側(cè)海馬CA1區(qū)每個(gè)視野下神經(jīng)元數(shù)目。 7、采用CREB、tau原位雜交檢測(cè)試劑盒檢測(cè)切片CREB mRNA、tau mRNA的表達(dá)。 8、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CREB與p-CREB表達(dá)。 9、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p-tau(Ser199/202)與tau-5表達(dá)。 10、原位雜交和免疫組織化學(xué)切片圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 定量分析各組大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)CREB mRN

5、A、CREB蛋白和p-CREB以及tau mRNA、p-tau(Ser199/202)和tau-5陽(yáng)性反應(yīng)物的平均光密度值，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)分析，樣本均數(shù)間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 11、Westem blot檢測(cè)海馬CREB和p-CREB的表達(dá)、圖像分析及數(shù)據(jù)處理。 12、Westem blot檢測(cè)海馬p-tau(Ser199/202)與tau-5的表達(dá)、圖像分析及數(shù)據(jù)處理。

6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、動(dòng)物行為學(xué)觀察按Longa法神經(jīng)功能評(píng)分為1～3分的動(dòng)物表現(xiàn)有明顯神經(jīng)功能受損癥狀，假手術(shù)動(dòng)物評(píng)分為0分。 2、TTC染色結(jié)果TTC染色發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組右紋狀體外側(cè)及皮質(zhì)外側(cè)有明顯的缺血灶，該區(qū)域?yàn)榇竽X中動(dòng)脈供血區(qū)，假手術(shù)動(dòng)物腦無(wú)缺血灶，證明模型制作成功。 3、切片組織病理學(xué)觀察與Nissl染色細(xì)胞計(jì)數(shù)HE和Nissl染色可見(jiàn)假手術(shù)組右側(cè)海馬結(jié)構(gòu)清晰，CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量多，胞漿中尼氏體清晰可

7、見(jiàn)。在缺血再灌注24 h組，右側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中出現(xiàn)了一些缺血樣改變，正常神經(jīng)元數(shù)量減少。NGF組、CGRP組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)比缺血再灌注組增多，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，NGF與CGRP合用組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)進(jìn)一步增多。 4、CREB原位雜交染色及定量分析結(jié)果假手術(shù)組海馬CA1區(qū)CREB mRNA有明顯表達(dá)，缺血再灌注組CA1區(qū)CREBmRNA陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物平均光密度值低于假手術(shù)組，NGF組和CGRP組的CREBmR

8、NA表達(dá)高于缺血再灌注組，NGF＆CGRP組CREB mRNA表達(dá)分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 5、CREB和p-CREB免疫組化染色及定量分析結(jié)果假手術(shù)組海馬CA1區(qū)CREB有明顯表達(dá)，缺血再灌注組CA1區(qū)CREB陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物平均光密度值低于假手術(shù)組，NGF組和CGRP組的CREB表達(dá)均高于缺血再灌注組，NGF&CGRP組的CREB陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 Sham組

9、CA1區(qū)P-CREB表達(dá)較少，I/R組P-CREB的表達(dá)明顯高于sham組，NGF組和CGRP組CA1區(qū)P-CREB的平均光密度值均大于I/R組和sham組，NGF&CGRP組P-CREB表達(dá)分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 6、Western blot檢測(cè)海馬CREB和P-CREB的表達(dá)結(jié)果Western印跡顯示在相對(duì)分子量43kD處I/R組CREB的積分光密度值(IDV值)比sham組小，而NGF組和CGRP組

10、海馬CREB的IDV值高于I/R組，NGF&CGRP合用組CREB表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)。I/R組p-CREB的IDV值高于sham組，NGF組和CGRP組P-CREB的IDV值均高于Sham組和I/R組，NGF&CGRP組P-CREB表達(dá)最高，分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 7、P-tau(Ser199/202)和tau-5免疫組化染色及定量分析結(jié)果p-tau在Sham組有表達(dá)，在缺血再灌注3 h明顯增

11、加，到12h、24h進(jìn)一步升高后逐漸下降，到72 h仍高于對(duì)照組水平(P<0.05)；NGF及CGRP明顯降低缺血再灌注海馬神經(jīng)元的p-tau(Ser199/202)免疫反應(yīng)性，NGF與CGRP合用進(jìn)一步降低缺血再灌注海馬神經(jīng)元p-tau(Ser199/202)表達(dá)(P<0.05)。缺血再灌注組tau-5陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度在各時(shí)點(diǎn)均高于假手術(shù)組；NGF組和CGRP組tau-5反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的平均光密度值均低于缺血再灌注組(P<0.05

12、)，NGF與CGRP合用明顯降低缺血再灌注海馬tau=5反應(yīng)性，但與單獨(dú)使用NGF或CGRP組相比，差異無(wú)顯著性。 8、Western blot檢測(cè)海馬p-tau(Ser199/202)和tau-5的表達(dá)結(jié)果缺血再灌注組p-tau免疫印跡IDV值較假手術(shù)組增高；NGF組和CGRP組p-tau條帶光密度值比缺血再灌注組減少，但高于假手術(shù)組；NGF與CGRP合用組p-tau條帶光密度值進(jìn)一步降低，分別低于I/R組和NGF、CGRP組

13、(P<0.05)。tau-5在I/R．組表達(dá)增多，NGF、CGRP處理后tau-5表達(dá)減少，低于缺血再灌注模型組(P<0.05)，NGF與CGRP合用處理后海馬tau-5表達(dá)比缺血再灌注模型組減少，但與NGF組、CGRP組比較無(wú)明顯變化。 9、tau．原位雜交染色結(jié)果tau mRNA陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，多位于胞漿，細(xì)胞核也有著色，各組大鼠海馬CA1區(qū)tau mRNA均有明顯表達(dá)，且表達(dá)的強(qiáng)弱相近，無(wú)明顯變化。 研究結(jié)論：

14、 1、NGF及CGRP改善局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)，二者促進(jìn)缺血神經(jīng)元的恢復(fù)可能是通過(guò)上調(diào)海馬神經(jīng)元內(nèi)CREB mRNA及其蛋白的表達(dá)、激活CREB來(lái)實(shí)現(xiàn)的，激活CREB可能是NGF及CGRP保護(hù)缺血神經(jīng)元的重要分子機(jī)制之一。 2、NGF及CGRP減輕局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬tau蛋白磷酸化程度，并下調(diào)tau．5蛋白的表達(dá)，而對(duì)tau mRNA影響不大，抑制tau蛋白磷酸化水平可能是NGF及CGRP保護(hù)缺血神經(jīng)元