CGRP和NGF對大鼠局灶性腦缺血再灌注Fas和ICAM-1表達(dá)的影響及對受損神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、目的：臨床上許多疾病(如腦血栓形成、腦栓塞、心跳驟停、休克等)都可導(dǎo)致腦缺血的發(fā)生。腦缺血發(fā)生后引起的病理生理過程復(fù)雜，可出現(xiàn)神經(jīng)元壞死、變性、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和/或凋亡，目前尚無有效安全的治療方法。以Fas系統(tǒng)為代表的死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞凋亡最主要的途徑之一。 缺血再灌注后，血腦屏障的破壞是造成再灌注損傷的重要基礎(chǔ)，其中ICAM-1起著重要作用。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是第一個利用基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的由37個氨基酸組成

2、的活性多肽，有強烈的舒張腦血管效應(yīng)，可預(yù)防和緩解腦血管痙攣。神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，可促進神經(jīng)元的分化，維持神經(jīng)元的生長、發(fā)育，促進受損神經(jīng)元的修復(fù)。CGRP和NGF廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并與腦缺血再灌注損傷有一定關(guān)系。CGRP和NGF對受損神經(jīng)元的保護作用的機制尚待研究。所以，我們通過線栓法阻斷大鼠MCA制備局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、原位雜交組織化學(xué)和顯微圖像分析等方法，研究外源性C

3、GRP和NGF對大鼠局灶性腦缺血再灌注Fas蛋白和mRNA、ICAM-1蛋白和mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及對缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷和腦梗塞體積的影響，探討CGRP和NGF對腦缺血再灌注損傷的作用機制。為缺血性腦血管病的病理生理機制的研究和治療方法的選擇及腦保護藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。 方法：1.實驗動物健康雄性SD大鼠162只，體重250～300克，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為：(1)假手術(shù)組(sham，n=6)；

4、(2)缺血再灌注組(I/R)；(3)CGRP治療組；(4)NGF治療組；(5)CGRP和NGF治療組。其中缺血再灌注組、CGRP組、NGF組、CGRP和NGF組在局灶性腦缺血2h后，又分為再灌注6h、12h、24h、48h和72h組，每組動物6只(n=6)。 2.局灶性腦缺血再灌注模型的制備大鼠10％水合氯醛腹膜腔注射麻醉(350mg/kg體重)，取頸前正中切口，分離結(jié)扎右頸外動脈、右頸總動脈，分離右頸內(nèi)動脈；在右頸總動脈結(jié)扎處

5、與右頸內(nèi)動脈起始部之間切口(或用5號注射針頭刺一口)，將涂有硅酮直徑0.28mm的尼龍線小心插入右側(cè)頸內(nèi)動脈約18.0±1.0mm，即可閉塞大腦中動脈，外留栓線10mm，固定栓線，縫合皮膚。2h后再次麻醉動物后剪開皮膚縫線，手術(shù)顯微鏡下輕輕拔出栓線約10mm以實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插栓線、不注射藥物外，其余步驟同上。 再灌注開始前經(jīng)左頸外動脈插入套管針至左頸內(nèi)動脈內(nèi)備用。缺血再灌注組：缺血2h后開始再灌注時經(jīng)套管針向左頸內(nèi)動脈

6、內(nèi)注入生理鹽水1ml，30min注射完；NGF組：注入NGF(500U/ml，1ml，大連司威特公司)，30min注射完；CGRP組：注入CGRP(1μg/ml，1ml，美國Sigma公司)，30min注射完；NGF與CGRP合用組：注入NGF(1000U/ml，0.5ml)和CGRP(2μg/ml，0.5ml)，30min注射完。注射完畢后拔出套管針，結(jié)扎左頸外動脈。 缺血再灌注各組在局灶性腦缺血2h再灌注6h時，參考ZeaL

7、onga等的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)對其進行神經(jīng)功能損傷評分，評分后制備冰凍切片，TTC染色測定梗塞體積，HE染色光鏡下觀察大鼠皮質(zhì)、海馬的組織學(xué)變化。 3.神經(jīng)功能損傷觀測按照ZeaLonga5級評分法評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。動物入選的標(biāo)準(zhǔn)：取評分為1、2、3分的動物。 4.HE、TTC染色觀察海馬組織病理學(xué)變化冰凍

8、切片經(jīng)37℃涼干，常規(guī)HE染色，TTC染色，光鏡下觀察假手術(shù)組和缺血再灌注組大鼠海馬組織病理學(xué)變化，及梗塞灶。 5.免疫組織化學(xué)、原位雜交檢測和顯微圖象分析及統(tǒng)計學(xué)處理進行免疫組織化學(xué)、原位雜交檢測各組于相應(yīng)時間點取材。用10％水合氯醛(350mg/kg體重)腹膜腔注射麻醉，快速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，肝素生理鹽水快速沖洗至清澈，再用含4％多聚甲醛的0.1mol/LPBS(含1/1000DEPC)灌注固定，斷頭取腦

9、，取兩耳極連線前6mm左右冠狀切面組織塊分成2塊，置入同一固定液中后固定1h。蒸餾水充分洗滌，一塊常規(guī)制成石蠟塊，另一塊置入含30％蔗糖的0.1mol/LPBS溶液(含1/1000DEPC)4℃過夜沉底后，用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，厚16μm，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩７謩e進行免疫組織化學(xué)和原位雜交檢測。用MetaMor-ph(美國)圖象分析系統(tǒng)測定各組海馬CA1區(qū)Fas蛋白和mRNA、ICAM-1蛋白和mRNA免疫陽性反應(yīng)物的平均灰度值，所得

10、數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件以兩樣本均數(shù)間t檢驗及方差分析多樣本均數(shù)間兩兩比較等方法作統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果：1.神經(jīng)功能損傷結(jié)果缺血再灌注組大鼠在缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷，其神經(jīng)功能損傷評分顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。CGRP和NGF治療組神經(jīng)功能損傷評分顯著低于缺血再灌注組(P＜0.01)。 2.腦梗塞體積檢測結(jié)果大鼠局灶性腦缺血再灌注24h后，腦梗塞體積為281±21mm3，經(jīng)頸內(nèi)動脈注射CGRP和

11、NGF后，梗塞體積縮小到226±13mm3，(P＜0.01)。 3.海馬組織病理學(xué)改變假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整；缺血組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，分布不均，細(xì)胞周圍間隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染。 4.Fas蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果假手術(shù)組未見Fas蛋白免疫陽性細(xì)胞，缺血組于再灌注6h后在海馬區(qū)可見Fas蛋白免疫陽性細(xì)胞，隨著再灌注時間的延長，陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，于再灌注24h時達(dá)高峰，以后開始逐漸下降。光鏡

12、下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞漿。缺血再灌注組Fas蛋白免疫陽性細(xì)胞平均灰度值在各時間段明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)；CGRP組和NGF組平均灰度值在各時間段均高于I/R組(P＜0.05)；CGRP與NGF合用組Fas蛋白免疫陽性細(xì)胞平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.05)。 5.FasmRNA原位雜交檢測結(jié)果假手術(shù)組未見FasmRNA免疫陽性細(xì)胞，缺血再灌注組在頂葉、海馬區(qū)可見FasmRNA免疫陽性細(xì)

13、胞。光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。在各相應(yīng)時間點，CGRP組和NGF組FasmRNA陽性反應(yīng)物的平均灰度值高于I/R組(P＜0.1)；CGRP與NGF合用組FasmRNA免疫陽性反應(yīng)物的平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.01)。 6.ICAM-1蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)及海馬未見ICAM-1陽性細(xì)胞，其平均光密度值只是其背景的非特異性反應(yīng)；缺血組于再灌注6h后在海馬區(qū)可見ICAM-1陽性

14、細(xì)胞，隨著再灌注時間的延長，大腦皮質(zhì)及海馬ICAM-1表達(dá)進一步增加，于再灌注24h時明顯，以后開始逐漸下降；光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。注射CGRP、NGF及CGRP&NGF后大腦皮質(zhì)及海馬ICAM-1表達(dá)明顯減少，CGRP組和NGF組平均光密度值在各時間點均明顯低于I/R組(P＜0.01)，CGRP組與NGF組比較平均光密度值無明顯差異(P＞0.05)，CGRP與NGF合用組平均光密度值低于CGRP組和NGF組(P＜0

15、.05)。 7.ICAM-1mRNA原位雜交檢測結(jié)果假手術(shù)組未見ICAM-1mRNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，缺血再灌注組在海馬區(qū)可見ICAM-1mRNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。CGRP組和NGF組ICAM-1mRNA陽性反應(yīng)物的平均灰度值高于缺血再灌注組(P＜0.01)；CGRP與NGF合用組ICAM-1mRNA陽性反應(yīng)物的平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.01)。 結(jié)論：1.

16、CGRP和NGF治療組神經(jīng)功能損傷顯著低于缺血再灌注組，提示CGRP和NGF對腦缺血再灌注受損神經(jīng)元的神經(jīng)功能有保護和恢復(fù)作用。 2.CGRP和NGF治療組顯著減少大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦梗塞體積，說明CGRP和NGF對腦缺血再灌注受損神經(jīng)元有保護和恢復(fù)作用。 3.大鼠局灶性腦缺血再灌注后Fas蛋白和mRNA，ICAM-1蛋白和mRNA過表達(dá)，提示Fas及ICAM-1參與腦缺血再灌注損傷的調(diào)亡機制。 4.CGR