微管相關(guān)蛋白-4在小鼠牙胚組織中的表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　 哺乳動物牙齒發(fā)育過程可分為牙胚的發(fā)生、牙胚的形成、細(xì)胞的分化、牙體組織的形成、牙根的發(fā)育以及牙齒的萌出。早期的牙胚發(fā)育過程包括蕾狀期、帽狀期和鐘狀期。
　　 眾多的信號分子參與了牙胚發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，其中包括TGF-β(transforming growth factor-β，轉(zhuǎn)化生長因子-β)，Wnt(wingless int，Wnt信號)，F(xiàn)GF（fibroblast growth factor，成纖維細(xì)

2、胞生長因子），Shh（sonic hedgehog，音猬因子）以及Syndecans(粘結(jié)蛋白聚糖）等。根據(jù)Ulrika等的研究，Syndecans作為信號分子的協(xié)同受體，其作用的實(shí)現(xiàn)依賴于微管蛋白的重排列，而微管蛋白的功能受到微管相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。MAP-4(microtubule-associated protein-4，微管相關(guān)蛋白-4)和β-tubulin(β-微管蛋白)分別是微管相關(guān)蛋白及微管蛋白中的重要一員，與細(xì)胞的多種生理活

3、動密切相關(guān)。研究它們在牙胚發(fā)育過程中分布和表達(dá)的變化有助于我們更深入的認(rèn)識牙胚發(fā)育過程中信號傳遞的過程和機(jī)制。
　　 小鼠磨牙的發(fā)育過程，作為哺乳類動物牙齒發(fā)育的模型，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于牙胚發(fā)育及信號調(diào)節(jié)方面的研究。本研究運(yùn)用免疫熒光顯微技術(shù)和免疫印跡技術(shù)研究不同發(fā)育階段的小鼠磨牙組織中MAP-4及β-tubulin的分布和表達(dá)，探討其對牙胚發(fā)育的影響。
　　 材料和方法:
　　 分別取胚胎(embyro，E)為1

4、3d、14d、15d、16d、18d的孕鼠，乙醚麻醉下剖開子宮，取出胎鼠鼠頭；取出生后( post natal，PN)1d、3d的幼鼠鼠頭。最后上述鼠頭組織立即進(jìn)行液氮速凍，入-80℃深凍冰箱保存，于恒冷箱中制作下頜第一磨牙冠狀位冰凍切片（7μm厚），而后密封保存于-20℃冰箱待用。采用H-E染色進(jìn)行下頜第一磨牙的精確定位。選出質(zhì)量良好的切片，以抗MAP-4和抗β-tubulin的多克隆抗體為-抗進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察二者

5、在小鼠牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)情況。
　　 在解剖顯微鏡下提取E15d和E18d胎鼠的下頜第一磨牙牙胚，稱重后按1：5比例加入生理鹽水，在冰上剪碎樣品，4℃500g離心5min，棄上清。按1:3比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃裂解過夜。4℃12000g離心30min，取上清，BCA檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量，每管30μg分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。運(yùn)用免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測MAP-4及β-tubulin的蛋白表達(dá)水平

6、。
　　 結(jié)果:
　　 免疫熒光染色結(jié)果顯示MAP-4和β-tubulin在各個(gè)時(shí)期的牙源性上皮和牙乳頭內(nèi)均有表達(dá)，且隨著發(fā)育的成熟，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)。但到硬組織形成期，二者的表達(dá)開始減弱。MAP-4表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈點(diǎn)塊狀，β-tubulin表達(dá)于細(xì)胞膜下，呈線狀。免疫印記的結(jié)果顯示MAP-4和β-tubulin在E15d和E18d的小鼠牙胚組織蛋白水平上均有表達(dá)，且后一時(shí)期比前一時(shí)期表達(dá)的灰度值要深。
　　 結(jié)