鈣磷骨水泥-杜仲葉提取物復(fù)合材料的研制和體內(nèi)外活性研究.pdf

1、本研究擬將杜仲葉提取物與磷酸鈣骨水泥(CPC)進(jìn)行有效的復(fù)合，制備成形態(tài)可預(yù)制的復(fù)合載體，并對(duì)其理化性能、體內(nèi)外生物活性進(jìn)行分析測(cè)試，旨在評(píng)價(jià)CPC/杜仲葉提取物復(fù)合材料修復(fù)頜面部骨缺損的效果和可行性。 研究方法： 1、復(fù)合材料的研制：通過(guò)二次煅燒牛骨和加入0.3M磷酸氫二銨(AP)的方法獲得羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HAP/β-TCP)兩相骨水泥，采用醇提水沉法并通過(guò)高效液相色譜法(HPLC法)提取和測(cè)定杜仲葉水溶性活

2、性物質(zhì)，并將兩者有效復(fù)合。采用凝固時(shí)間、抗壓強(qiáng)度、水中溶解度和PH值、孔隙率的測(cè)定，以及掃描電鏡觀察、X射線衍射分析(XRD)和傅里葉紅外光譜分析(FTIR)，對(duì)復(fù)合材料的理化特性進(jìn)行檢測(cè)。 2、復(fù)合材料體外生物活性研究：分別將含0、0.152、0.304、0.608mg/ml杜仲葉提取物的復(fù)合材料塊與大鼠成骨樣細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)體外DMEM培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48小時(shí)，通過(guò)對(duì)同位素3H-TdR摻入試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖以及用倒

3、置顯微鏡和掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞在材料周?chē)捅砻娴纳L(zhǎng)、增殖、附著情況，以評(píng)價(jià)此復(fù)合材料的細(xì)胞相容性，并確定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中與CPC復(fù)合的最佳杜仲葉提取物的濃度。 3、復(fù)合材料體內(nèi)生物活性研究：根據(jù)體外活性測(cè)試的結(jié)果，選擇最佳杜仲葉提取物濃度，與CPC復(fù)合形成CPC/杜仲葉提取物復(fù)合人工骨。制作兔顱骨缺損模型(3個(gè)9mm大小的孔型顱骨缺損)，分別植入CPC/杜仲葉提取物復(fù)合人工骨、純CPC人工骨和空白對(duì)照，共計(jì)9只兔子。分別在4、8、1

4、2周各處死3只兔子，切取標(biāo)本，數(shù)字×線、常規(guī)HE組織切片和掃描電鏡觀察材料在動(dòng)物體內(nèi)的組織相容性和生物活性。 研究結(jié)果： 1、本研究所制備的CPC經(jīng)XRD測(cè)定為HAP、βTCP兩個(gè)晶相，復(fù)合物的凝固時(shí)間為8～9分鐘，符合臨床操作要求，復(fù)合一定濃度的杜仲葉提取物不影響CPC的凝固時(shí)間及抗壓強(qiáng)度，抗壓強(qiáng)度為19Mpa左右，適合非負(fù)重骨缺損的修復(fù)；CPC在水中的溶解度為2.34％；水中PH值在6.8～7.5之間，適合成骨細(xì)胞生

5、長(zhǎng)的要求；CPC孔隙率為31.3％，掃描電鏡下觀察到材料呈疏松的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑5～100μm之間；XRD和FTIR分析發(fā)現(xiàn)復(fù)合一定濃度的杜仲葉提取物不影響CPC的理化性能，杜仲葉提取物是以無(wú)定形形式存在于CPC材料中。 2、CPC/杜仲葉提取物復(fù)合材料與大鼠MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞共同培養(yǎng)中，成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，未出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡及中毒現(xiàn)象。成骨細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)即貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)與傳代前一致，特別是0.304mg/ml組培養(yǎng)4

6、8小時(shí)后可見(jiàn)材料周?chē)?xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈不規(guī)則多角形，相互重疊，連接成網(wǎng)絡(luò)狀生長(zhǎng)。同位素?fù)饺朐囼?yàn)顯示培養(yǎng)48小時(shí)，復(fù)合0.304mg/ml濃度杜仲葉提取物的CPC對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)。0.304mg/ml組培養(yǎng)48小時(shí)后掃描電鏡下可見(jiàn)成骨細(xì)胞在材料表面大量增殖，覆蓋了大部分材料表面，呈多角扁平形，密集處可見(jiàn)細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞間突觸接觸多而緊密，表明CPC/杜仲葉提取物復(fù)合材料具有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。 3、將此濃度的復(fù)合材

7、料植入兔顱骨缺損模型，并與不含杜仲的CPC對(duì)照研究，連續(xù)觀察3個(gè)月，無(wú)一例出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，X線及掃描電鏡觀察，可見(jiàn)人工骨與骨組織間隙逐漸模糊、縮小，與骨組織連接逐漸緊密，陰影處密度逐漸增加。實(shí)驗(yàn)組8周時(shí)已與骨組織連接緊密，邊緣部分隱約可見(jiàn)骨紋理，12周時(shí)材料邊緣模糊，骨組織部分長(zhǎng)入材料內(nèi)；組織學(xué)檢查表明隨著時(shí)間的推移，膠原纖維逐漸鈣化，新生骨小梁從邊緣向材料內(nèi)部生長(zhǎng)，骨新生活躍，有骨島形成，12周時(shí)達(dá)到骨性連接，并有血管化生成。而對(duì)照