Chemerin與妊娠期糖尿病的相關(guān)研究.pdf

1、妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖尿病，妊娠期糖尿病在全世界尤其是在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率正在逐年上升。GDM是威脅孕婦、胎兒健康的常見妊娠期并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致孕婦能量代謝功能紊亂，從而發(fā)生巨大兒、羊水過多、自然流產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒窘迫、死胎、死產(chǎn)、新生兒低血糖、新生兒低鈣血癥及高膽紅素血癥等，對(duì)母嬰危害較大。其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，目前較一致的觀點(diǎn)為:GDM與2

2、型糖尿病(T2DM)有著相似的發(fā)病基礎(chǔ)，即遺傳基因缺陷基礎(chǔ)上存在胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和胰島素分泌功能相對(duì)不足，其中IR占主要位置。
　　脂肪組織是人體最重要的內(nèi)分泌器官之一，合成和分泌多種脂肪因子，包括瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）和新發(fā)現(xiàn)的

3、抵抗素(resistin)、內(nèi)酯素(visfatin)、apelin、脂類快速趨化因子（fasting-induced adipose factor，F(xiàn)IAF）、視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol-binding protein4，RBP4）及趨化素(chemerin)等。Chemerin在人體的脂肪組織、腎上腺、肝臟、肺、胰腺、胎盤、卵巢、皮膚等都有表達(dá)，其中主要表達(dá)于白色脂肪組織、肝臟和肺，參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等。其表達(dá)水平與肥

4、胖相關(guān)，并有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化、脂解，促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑等生物學(xué)效應(yīng)。
　　作為新近被認(rèn)識(shí)的脂肪因子Chemerin在肥胖、胰島素拮抗、代謝綜合征和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用引起了越來越多的關(guān)注和越來越深入的研究。但正因?yàn)槠湫陆话l(fā)現(xiàn)而且存在著人種等差異，目前對(duì)于它的認(rèn)識(shí)還很不全面，許多問題尚待闡明。如Chemerin基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)的分

5、布及與脂肪組織中Chemerin mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的表達(dá)和血漿濃度之間存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)程度;以及與肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常病變程度上的相關(guān)性均未被揭示。
　　妊娠期糖尿病往往結(jié)合了肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常，但是Chemerin與妊娠期糖尿病的相關(guān)研究極少。本研究擬從整體水平探討妊娠期糖尿病外周血和臍帶血Chemerin的變化以及與代謝指標(biāo)的關(guān)系;從細(xì)胞水平和分子水平探討妊娠期糖尿病的脂肪細(xì)胞和胎盤組織Chemerin

6、mRNA和蛋白表達(dá);同時(shí)采用基因擴(kuò)增后直接測(cè)序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布;進(jìn)一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)系。從而深入研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制，為篩選有價(jià)值的疾病標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)，完善妊娠期糖尿病的預(yù)測(cè)和診斷方法，以期為改善妊娠期糖尿病圍產(chǎn)結(jié)局提供新途徑。
　　第一部分妊娠期糖尿病患者Chemerin的變化及其臨床意義
　　研究目的:
　　分別測(cè)

7、定GDM組和正常對(duì)照組孕婦外周血和臍血Chemerin的變化及其與BMI、血糖、血脂等指標(biāo)的相關(guān)性，探討Chemerin與GDM的關(guān)系。
　　方法:
　　選取2012年1月到2012年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院待產(chǎn)的孕婦，參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組，同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標(biāo)與GDM組相匹配的孕婦43例作為正常對(duì)照組，所有入選病例均于3

8、7-40周分娩。入院后由專人詳細(xì)記錄孕婦年齡、身高、孕前體重以及孕期體重增加量;同時(shí)分別測(cè)定兩組分娩前空腹血糖(Fast Plasm Glucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(Fast Insulins，F(xiàn)ins)、糖化血紅蛋白(HemoglobinA1c，HbA1c)、總膽固醇(Total Cholesterole，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，并計(jì)

9、算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、孕前BMI、分娩時(shí)BMI。新生兒娩出斷臍后，立即用一次性無菌注射器從臍帶胎盤端抽取靜脈臍血10ml。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定外周血及臍血Chemerin值;同時(shí)測(cè)量新生兒的體重(kg)和身長(zhǎng)(Ht)，計(jì)算BMI。
　　結(jié)果:
　　1.臨床資料比較:兩組孕婦的年齡、孕周、產(chǎn)次、孕次、孕前BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。GDM組孕期體重增加及分娩時(shí)BMI明顯高于正常對(duì)照組（

10、P均＜0.05）。
　　2.兩組血糖、血脂、炎癥指標(biāo)、胰島素和Chemerin的比較:GDM組外周血Chemerin水平顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05);同時(shí)，F(xiàn)PG、Fins、TG、HbA1c及HOMA-IR、CRP、WBC均高于正常對(duì)照組（P均＜0.05）;而兩組的TC、HDL、LDL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.外周血Chemerin與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析:正常對(duì)照組Chemerin與FPG和HOM

11、A-IR以及TG均負(fù)相關(guān)(r分別為-0.582，-0.376，-0.427，P分別為0.000，0.016，0.008);而GDM組Chemerin與上述指標(biāo)之間無相關(guān)性，但是與孕期體重增加量和分娩時(shí)BMI呈正相關(guān)（r分別為0.336、0.340，P分別為0.026，0.022）。
　　4.兩組臍帶血Chemerin水平和新生兒體質(zhì)量比較:GDM組臍帶血Chemerin水平顯著高于對(duì)照組，分別為22.50±4.36pg/ml和19

12、.85±6.06pg/ml，差異有顯著性(P＜0.05); GDM組新生兒體重、BMI分別與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。
　　5.兩組外周血和臍血中Chemerin水平的比較:GDM組外周血、臍血Chemerin水平均顯著高于正常對(duì)照組相應(yīng)測(cè)定值(P分別為0.001、0.026); GDM組和正常對(duì)照組的臍血Chemerin水平顯著高于同組外周血中的水平（P分別為0.005、0.029）。
　　結(jié)論

13、:
　　(1)正常對(duì)照組外周血Chemerin水平與血糖、血脂代謝指標(biāo)相關(guān)，提示Chemerin參與正常妊娠期能量代謝調(diào)節(jié)，保持妊娠期血糖、血脂水平穩(wěn)定。
　　(2)GDM組外周血Chemerin水平明顯高于正常對(duì)照組，而且與孕期體重增加和分娩時(shí)BMI相關(guān)，但是與代謝指標(biāo)無相關(guān)性。提示GDM組孕期體重增加過多導(dǎo)致Chemerin功能失衡，可能與GDM能量代謝異常有關(guān)。
　　(3)GDM組新生兒出生體重和臍帶血Cheme

14、rin水平均較正常對(duì)照組明顯增加，推斷Chemerin與GDM子代的并發(fā)癥有關(guān)。
　　第二部分妊娠期糖尿病患者脂肪和胎盤Chemerin mRNA以及蛋白表達(dá)的變化
　　研究目的:
　　分別檢測(cè)GDM組和正常對(duì)照組脂肪和胎盤組織中Chemerin mRNA以及蛋白表達(dá)的變化，探討Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中的分布情況以及與GDM的關(guān)系。
　　方法:
　　選取2012年1月到2012年10月在浙江

15、大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院待產(chǎn)的孕婦，參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組，同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組相匹配的孕婦43例為正常對(duì)照組，所有入選病例均于37-40周分娩。擇期剖腹產(chǎn)手術(shù)時(shí)采集產(chǎn)婦下腹部皮下脂肪約5g;胎盤娩出后留取臍帶根部胎盤組織1cm×1cm×1cm，所有組織均液氮保存。通過熒光定量PCR檢測(cè)GDM組和正常對(duì)照組脂肪及胎盤組織中Chemerin

16、mRNA表達(dá);通過Westernblot檢測(cè)兩組脂肪和胎盤組織中Chemerin蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.總RNA提取的質(zhì)量檢測(cè):通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。紫外燈下可見28s，18s，5s三條rRNA的條帶清晰，28s條帶的強(qiáng)度高于18s將近2倍，18s條帶的強(qiáng)度又高于5s，表明RNA質(zhì)量良好。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增(SYBRGreenI熒光定量PCR相對(duì)定量法)。
　　2.

17、1擴(kuò)增曲線:
　　通過PCR儀自動(dòng)生成的擴(kuò)增曲線可以看到目的基因Chemerin以及內(nèi)參基因Actin擴(kuò)增曲線的線條圓滑，跨度大體一致，提示基因的擴(kuò)增表達(dá)情況良好。
　　2.2兩組脂肪和胎盤組織Chemerin mRNA表達(dá)比較:
　　GDM組脂肪組織和胎盤組織Chemerin mRNA平均表達(dá)量均高于正常對(duì)照組。差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　3.兩組脂肪和胎盤組織Chemerin蛋白表達(dá)比較:經(jīng)過灰度分

18、析統(tǒng)計(jì)，GDM組脂肪和胎盤Chemerin/GAPDH均值均明顯高于正常對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1) Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中均有表達(dá)，參與正常妊娠生理代謝過程。
　　(2) GDM組脂肪組織和胎盤Chemerin mRNA和蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，提示脂肪源性和胎盤源性的Chemerin參與GDM的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分妊娠期糖尿病患者Chemerin基

19、因的單核苷酸多態(tài)性分析
　　研究目的：
　　采用基因擴(kuò)增后直接測(cè)序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布;進(jìn)一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)系。
　　方法:
　　選取2012年1月到2013年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院分娩的孕婦，參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM330例為實(shí)驗(yàn)組;同期選取年齡、孕周、孕前體重指

20、數(shù)等指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組相匹配的孕婦329例作為正常對(duì)照組，所有入選病例均于37-40周在本院分娩。各受試者進(jìn)行空腹血糖、甘油三酯等生化指標(biāo)的檢測(cè)。基于文獻(xiàn)、NCBI及生物信息學(xué)軟件，篩查到 rs3735170、 rs6970196、 rs10244748、 rs17173608、 rs1804764、 rs3210475、rs10278590(rs4721)、rs3735168、rs9942696、rs17835937十個(gè)位點(diǎn)。提取所有受試者

21、基因組DNA，用直接測(cè)序法分析上述位點(diǎn)基因型，并進(jìn)行相關(guān)分析。
　　結(jié)果：
　　1.研究對(duì)象的臨床特征:兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的年齡、孕周、孕前BMI、SBP、DBP、TC、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、ALT、GOT均沒有顯著性差異（P均＞0.05）;兩組FPG、TG、WBC、CRP、HOMA-IR、Fins均有顯著性差異（P均＜0.05）。
　　2.測(cè)序:各SNP位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果均與探針法分型結(jié)果完全一致。
　　3

22、.基因型和等位基因頻率分析
　　3.1 HWE檢驗(yàn):
　　經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)分析，7個(gè)位點(diǎn)的P值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于界值0.05，所研究的7個(gè)SNPs位點(diǎn)上觀察值與期望值相吻合，各基因頻率達(dá)到遺傳平衡，研究資料具有群體代表性，證明它們符合Hardy-Weinberg平衡。
　　3.2各SNP位點(diǎn)病例對(duì)照研究
　　rs3735170位點(diǎn)的C等位基因頻率在孕婦GDM病例組中為13.5％，正常對(duì)照組中為33.4％

23、，C等位基因?yàn)镚DM的保護(hù)因素(P=0.038)，OR為0.303(0.103-0.886);T等位基因頻率在GDM組為86.5％，正常對(duì)照組為66.6％，攜帶C的基因型CC+CTvsTT在GDM組中的分布頻率亦降低，P值為0.027，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　rs17173608的C等位基因頻率在GDM組為1.7％，正常對(duì)照組為13.3％，C等位基因?yàn)镚DM的保護(hù)因素(P=0.039)，OR為0.132(0.015-1.177);A

24、等位基因頻率在GDM組為98.3％，在正常對(duì)照組為86.7％，攜帶C的基因型CC+CA vs AA在GDM組中的分布頻率亦降低，P值為0.039，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　rs9942696的T等位基因頻率在GDM組為25.2％，正常對(duì)照組為16.3％，T等位基因?yàn)镚DM的高危因素，OR為3.354(1.062-10.590);C等位基因頻率在GDM組為74.8％，在正常對(duì)照組為83.7％，攜帶T的基因型TT+TC vs CC在GDM

25、組中的分布頻率升高，P值為0.035，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　其余SNP位點(diǎn)的等位基因及攜帶的相關(guān)基因型在兩組間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3LD檢驗(yàn):
　　沒有位點(diǎn)在同一個(gè)LD block內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)有與GDM發(fā)生相關(guān)的單倍體型。
　　4.各基因型間臨床及生化指標(biāo)比較:rs17173608和rs9942696位點(diǎn)各基因型之間未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異指標(biāo);rs3735170位點(diǎn)在孕期體重增加、FPG、TC、LDL指標(biāo)中存在基因