低磷脅迫下玉米突變體Qi319-96高光效機(jī)制的解析及轉(zhuǎn)基因耐鹽耐旱棉花新種質(zhì)的創(chuàng)制.pdf

1、一、低磷脅迫下玉米突變體Qi319-96高光效機(jī)制的解析
　　作物光合效率的提升與作物產(chǎn)量的提高密切相關(guān)，了解植物磷效率與光合作用的關(guān)系是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題。在玉米突變體篩選中發(fā)現(xiàn)耐低磷突變體Qi319-96與其來(lái)源親本Qi319相比在低磷脅迫下具有更高的光合效率。本工作在無(wú)機(jī)磷酸鹽充足（+Pi，1000μM KH2PO4）和缺乏（-P，5μM KH2PO4）條件下培養(yǎng)玉米Qi319-96和Qi319植株，以玉米葉片為材料進(jìn)

2、行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和生理學(xué)研究，試圖探討低磷脅迫下Qi319-96高光合效率的分子機(jī)制。
　　突變體Qi319-96耐低磷能力的提高與其改善細(xì)胞內(nèi)部Pi的利用效率有關(guān)
　　低磷水平限制了植物生長(zhǎng)和新陳代謝。在低磷條件下，Qi319和Qi319-96冠部的總磷含量沒(méi)有顯著差異，但Qi319-96的Pi含量比Qi319高52.94％;Qi319-96具有更高的葉綠素含量和光合能力;Qi319和Qi319-96葉片的淀粉

3、和蔗糖含量也不同，Qi319-96葉片比Qi319含有更多的蔗糖。Pi饑餓下，Qi319-96可以更好地調(diào)整膜脂質(zhì)組成，有更高的V-ATPase活性水平，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)Pi的循環(huán)再利用;葉綠素生物合成得到改善，Qi319-96中幾種卡爾文循環(huán)和“CO2泵”關(guān)鍵酶的活性水平也顯著高于Qi319，這導(dǎo)致低磷脅迫下Qi319-96中的光合作用性能優(yōu)于Qi319。Qi319-96對(duì)低磷脅迫耐受性的提高是由于其改善了細(xì)胞內(nèi)部Pi的利用效率，耐低磷玉

4、米新種質(zhì)可以利用細(xì)胞工程手段有效獲得。
　　miR395和miR399參與了玉米突變體Qi319-96葉片的Pi水平調(diào)控
　　MicroRNA(miRNA)參與了調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)等多種生理過(guò)程。在+P和-P條件下利用測(cè)序技術(shù)比較了Qi319和Qi319-96葉片中miRNA的表達(dá)水平。在+P下發(fā)現(xiàn)有10個(gè)已知miRNA家族的23個(gè)成員和40個(gè)新miRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)。在-P下有8個(gè)玉米已知miRNA家族的34個(gè)成

5、員和23個(gè)新miRNA在Qi319和Qi319-96間表現(xiàn)出不同表達(dá)水平。-P下一些靶基因的表達(dá)水平在Qi319和Qi319-96間顯著不同，miR395和miR399在玉米突變體Qi319-96葉片的Pi水平調(diào)控中扮演著重要角色。
　　Qi319-96在低磷脅迫下有更好的光系統(tǒng)性能和碳固定系統(tǒng)性能
　　磷饑餓降低了玉米葉片的Pn和Gs，但Ci增加，非氣孔因素導(dǎo)致了Pn的下調(diào)。低磷下Fv/Fm、ΦPSⅡ、 RC/CS、ABS

6、/CS、ETo/Cs、TRo/CS、Ψo、ΔIr/Io、Φ(PSⅠ/PSⅡ)和RuBPcase羧化酶羧化活性下調(diào)，而DIo/CS、Vj、Vi增加，表明磷饑餓對(duì)整個(gè)電子傳遞鏈造成了傷害，降低了光系統(tǒng)的電子傳遞能力，吸收光能的熱耗散增加，ATP含量降低，碳同化速率下調(diào)。不同基因型比較，Qi319-96具有更好的Ψo、ΔIr/Io、Φ(PSⅠ/PSⅡ)和RuBPcase羧化酶羧化活性，低磷脅迫下Qi319-96與Qi319相比具有更高的ATP

7、水平和二氧化碳同化能力。
　　葉綠體高豐度差異表達(dá)蛋白在Qi319-96低磷耐受性的貢獻(xiàn)在于促進(jìn)光系統(tǒng)的穩(wěn)定性、協(xié)調(diào)性和高效性
　　葉綠體作為光合作用的位點(diǎn)，與植物生長(zhǎng)和非生物逆境響應(yīng)密切相關(guān)。對(duì)Qi319-96和Qi319的葉綠體蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析，試圖了解Qi319-96具有更好碳同化能力的原因。在低磷脅迫下二維凝膠電泳圖中，與Qi319相比Qi319-96顯著上調(diào)的差異表達(dá)蛋白為27個(gè)，其中24個(gè)得到質(zhì)譜鑒定。這些

8、鑒定的蛋白可分為四類(lèi):第一類(lèi)是光合作用參與蛋白，包括RuBisCO、ATP合酶CF1-β亞基、ATP合酶CF1-α亞基、PSⅡ放氧增強(qiáng)蛋白;第二類(lèi)是參與光合作用系統(tǒng)穩(wěn)定的蛋白，包括PSⅡ穩(wěn)定性/裝配因子HCF136、FtsH蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白;第三類(lèi)是電子傳遞鏈相關(guān)蛋白，包括Cytb6/f復(fù)合體鐵硫亞基、玉米葉鐵氧還蛋白NADP+還原酶;第四類(lèi)為其他蛋白，包括肽-脯酰順?lè)串悩?gòu)酶、病程相關(guān)蛋白等。這些蛋白在Qi319-96的葉綠體

9、中高豐度高累積起到了促進(jìn)光系統(tǒng)的穩(wěn)定性、協(xié)調(diào)性和高效性的作用，在磷饑餓下Qi319-96具有更好的電子傳遞性能和碳同化能力。
　　以上工作初步揭示了Qi319-96低磷下高光效的機(jī)制，即低磷耐受性的增加是由于細(xì)胞內(nèi)Pi利用效率的提高，低磷脅迫下Qi319-96的光合作用系統(tǒng)具有更好的光系統(tǒng)性能和羧化系統(tǒng)性能。本工作為了解玉米光合作用系統(tǒng)應(yīng)對(duì)低磷脅迫的機(jī)制提供了新信息，有望為高光效玉米改良提供新的策略。
　　二、轉(zhuǎn)基因耐鹽耐旱

10、棉花新種質(zhì)的創(chuàng)制
　　干旱、高鹽度嚴(yán)重制約棉花的生產(chǎn)和影響纖維質(zhì)量。生產(chǎn)上迫切需要培育耐鹽耐旱棉花品種，以在水分脅迫和/或高鹽分條件下維持棉花的生產(chǎn)能力，實(shí)現(xiàn)棉花穩(wěn)產(chǎn)和纖維品質(zhì)的穩(wěn)定。在這部分工作中，將來(lái)自鹽芥的TsVP基因(編碼H+-PPase)、來(lái)自擬南芥的AtNHX1基因（編碼Na+/H+ Antiporter）和來(lái)自玉米的ZmPLC1基因（編碼PI-PLC）分別導(dǎo)入棉花，采用室內(nèi)選擇結(jié)合大田測(cè)試的方法，對(duì)轉(zhuǎn)TsVP、轉(zhuǎn)Ts

11、VP-AtNHX1、轉(zhuǎn)ZmPLC1基因棉花的耐鹽性或抗旱性進(jìn)行了室內(nèi)和大田測(cè)試，選育了耐鹽耐旱性提高的轉(zhuǎn)TsVP、轉(zhuǎn)TsVP-AtNHX1、轉(zhuǎn)ZmPLC1基因棉花，培育出一批棉花耐鹽抗旱新材料。
　　鹽脅迫下TsVP因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因棉花的出苗率和在鹽堿地中的產(chǎn)量
　　棉花出苗和成苗是鹽漬地植棉的關(guān)鍵，鹽漬地中棉花的籽棉產(chǎn)量也為人們所關(guān)注。對(duì)表達(dá)TsVP基因和受體（野生型）棉花在鹽堿地中的出苗時(shí)間、出苗率、成苗率、蕾期葉片

12、碳同化能力、籽棉產(chǎn)量和棉纖維品質(zhì)等進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)價(jià)選育出的表達(dá)TsVP基因的棉花育種材料的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果表明在鹽堿地中表達(dá)TsVP基因棉花的出苗時(shí)間與野生型相比可提前2d，且具有更高的出苗率和成苗率。在2013年的大田試驗(yàn)中，表達(dá)TsVP的棉花的CO2同化速率顯著高于受體LM1138。表達(dá)Ts VP基因的株系TP1、TP2和TP3的凈光合速率分別高于受體30.75％、45.72％和50.61％，PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）也分別高于

13、野生型25.00％、42.50％和45.00％，表達(dá)TsVP的棉花具有比受體LM1138更好的碳同化能力和光合電子傳遞效率。過(guò)表達(dá)TsVP基因的棉花籽棉產(chǎn)量比野生型平均提高14.81％，與野生型相比棉纖維的品質(zhì)也有所提高。溫室內(nèi)育種盤(pán)的種子出苗試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)NaCl濃度大于100mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系50％種子出苗所需的時(shí)間顯著少于受體LM1138。因此，我們的工作表明轉(zhuǎn)TsVP基因棉花可用于提高鹽漬地中棉花的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和改善棉纖維質(zhì)量。<

14、br>　　轉(zhuǎn)AtNHX1-TsVP雙基因提高了棉花的耐鹽性和鹽堿地中的籽棉產(chǎn)量
　　為了提高棉花的高鹽耐受能力，在春棉GK35中共表達(dá)了AtNHX1和TsVP基因。無(wú)論在溫室鹽脅迫下還是在東營(yíng)鹽堿地中，棉花葉片的相對(duì)含水量下降，但表達(dá)AtNHX1-TsVP的株系A(chǔ)T3比WT具有更高的相對(duì)水含量，表達(dá)TsVP-AtNHX1基因增強(qiáng)了棉花細(xì)胞的保水能力。在溫室鹽脅迫下或者在鹽堿地中轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)T3葉片中陽(yáng)離子總摩爾數(shù)分別比WT提高35

15、.79％和23.87％，葉片飽和滲透勢(shì)也比WT分別降低23.88％和22.01％，這些細(xì)胞具有較低的飽和滲透勢(shì)，有助于轉(zhuǎn)基因棉花在鹽脅迫下維持更好的水分吸收和持水能力，保持較高的相對(duì)水含量，促使表達(dá)AtNHX1-TsVP的棉花維持更高的光合作用能力。光合參數(shù)測(cè)定表明，表達(dá)TsVP-AtNHX1的棉花比WT具有更高的Pn和Gs。在鹽堿地中表達(dá)AtNHX1-TsVP的棉花的出苗時(shí)間與受體GK35相比可提前2d。轉(zhuǎn)AtNHX1-Ts VP基因

16、棉花具有比野生型(29.53％)更高的出苗率(53.22％)和比野生型(25.29％)更高的成苗率(49.45％)，在萌發(fā)期和苗期呈現(xiàn)出更高的耐鹽能力。轉(zhuǎn)AtNHX1-TsVP基因棉花在鹽堿地中表現(xiàn)出較高的籽棉產(chǎn)量，與野生型相比，平均增產(chǎn)22.46％。轉(zhuǎn)AtNHX1-TsVP基因棉花耐鹽性的增強(qiáng)可能與葉中更多的Na+、K+和Ca2+累積相關(guān)，這些陽(yáng)離子的大量積累可能是AtNHX1-TsVP基因共表達(dá)導(dǎo)致的結(jié)果。陽(yáng)離子在細(xì)胞中的適度積累有

17、利于在鹽脅迫下植物細(xì)胞維持離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞滲透勢(shì)，從而賦予葉片細(xì)胞更高的相對(duì)水含量和維持較高的碳同化能力。轉(zhuǎn)AtNHX1-TsVP基因棉花具有提高鹽堿地中棉花產(chǎn)量的潛力，可應(yīng)用于提高我國(guó)鹽漬田的籽棉產(chǎn)量。
　　轉(zhuǎn)mPLC1基因提高了棉花的耐旱性和干旱脅迫下的籽棉產(chǎn)量
　　PI-PLC在植物耐旱機(jī)制中起著重要作用。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZmPLC1基因?qū)胧荏w魯棉研19(Lu19)中獲得了表達(dá)ZmPLC1的棉花，Southern印跡

18、分析、qRT-PCR和PI-PLC活性測(cè)定結(jié)果表明ZmPLC1基因整合到棉花基因組中并在細(xì)胞中有效表達(dá)。在苗期、現(xiàn)蕾期及花期三個(gè)階段研究了表達(dá)ZmPLC1的棉花對(duì)干旱逆境的耐受性。結(jié)果表明，在干旱生境下，表達(dá)ZmPLC1的株系PC1、PC2、PC3具有比受體Lu19更高的相對(duì)含水量、更好的滲透調(diào)節(jié)、改善的光合作用速率、更低的離子泄漏、更小的脂質(zhì)膜過(guò)氧化和具有更高的籽棉產(chǎn)量。在新疆大田自然干旱條件下，轉(zhuǎn)基因株系PC1、PC2、PC3與野生

19、型(WT)相比，蕾花期葉片具有更好的二氧化碳同化速率，更值得關(guān)注的是，在大田干旱條件下表達(dá)ZmPLC1的株系具有更高的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。表達(dá)ZmPLC1的株系PC1、PC2、PC3與WT相比顯著增強(qiáng)了對(duì)干旱逆境的耐受性，且這種耐受性的提高與干旱脅迫下細(xì)胞積累更多溶質(zhì)和ABA含量變化有關(guān)。
　　依據(jù)溫室和大田的測(cè)試結(jié)果，轉(zhuǎn)TsVP、TsVP-AtNHX1和ZmPLC1基因的棉花提高了抗逆性，在干旱或高鹽分條件下具有更高的籽棉產(chǎn)量。 TsVP