抗藥木霉菌高效生防菌株生物學(xué)及其制劑加工技術(shù).pdf

1、針對目前有關(guān)高抗多種化學(xué)殺菌劑的木霉(Trichodermaspp)菌研究較少的情況，本論文進行了兩方面的研究。第一，以農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)污水生化處理站的活性污泥為材料，利用平板稀釋法分離到9株木霉菌株。通過生物測定表明，篩選菌株對生產(chǎn)中常用的化學(xué)殺菌劑具有很高的抗藥性。明確了9個菌株的抗性生物學(xué)特性、抗藥性穩(wěn)定性和遺傳特性。第二，研究了抗藥性木霉菌株THY7的“開放式”新型發(fā)酵工藝、“伴侶式”新型制劑加工工藝以及“分離式”可濕性粉劑加工工藝

2、，并對新制劑與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合作用控制番茄灰霉病進行了驗證。具體研究結(jié)果如下： 1高抗化學(xué)殺菌劑生防木霉菌株的篩選及抗藥性生物學(xué)1.1抗藥性木霉菌株的篩選以農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)污水處理站活性污泥和污水為材料，利用平板稀釋法分離純化到9株木霉菌株，編號為：THY1～THY9同時，從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)科技示范園土壤中分離純化得到6株木霉，編號為：TAU1～TAU6。 1.2木霉菌株對常用化學(xué)殺菌劑抗藥性水平測定采用改進孢子萌發(fā)法和生長速率法

3、，測定了12種生產(chǎn)中常用殺菌劑對木霉菌株的毒力。結(jié)果表明，9個木霉菌株對測定藥劑多菌靈、甲基硫菌靈、乙霉威、三唑酮、福美雙、代森錳鋅、腐霉利、甲霜靈、霜脲氰、霜霉威等均具有高抗藥性。從特殊環(huán)境中分離的高抗多種化學(xué)殺菌劑的木霉菌株在國內(nèi)外尚未見報道。 從土壤中分離的6個野生木霉菌株對苯基酰胺類的甲霜靈、氨基甲酸酯類的霜霉威和取代脲類的霜脲氰三類殺菌劑表現(xiàn)出較好的抗藥性，EC50值都大于1000mg/L，對其它類別的殺菌劑則非常敏感

4、。證明木霉菌存在自然抗藥性現(xiàn)象，野生木霉菌的自然抗藥性與菌株的來源無關(guān)，主要與殺菌劑的特性有關(guān)。這一研究結(jié)果對協(xié)調(diào)木霉菌生物防治和化學(xué)防治的關(guān)系有一定指導(dǎo)作用。 1.3抗藥性木霉菌株的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，來源于活性污泥的9個抗藥性木霉菌株在孢子萌發(fā)、菌絲生長、產(chǎn)孢量、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力、對病原菌的生防潛力、植物葉片和土壤中定殖能力等方面均表現(xiàn)出良好的特性，優(yōu)于從土壤中篩選的野生菌株。9個菌株對多種病原菌生防作用顯著，為植物病害生

5、物防治和化學(xué)防治協(xié)同作用提供了理想的生防菌株。 1.4抗藥性生防木霉菌株的抗性穩(wěn)定性及抗性遺傳抗藥性木霉菌株作為菌種4℃保藏2年，抗藥性無衰退，抗藥性穩(wěn)定。在培養(yǎng)菌株的PDA平板中添加濃度為40mg/L的復(fù)合殺菌劑作為選擇壓，抗藥性無減退。該研究為抗藥性生防木霉菌株的合理保藏和培養(yǎng)提供了科學(xué)依據(jù)。 相對敏感菌株TAU1和抗藥性菌株THY7分別以10mg/L多菌靈和50℃熱滅活100min作為遺傳標記。通過原生質(zhì)體融合研究

6、表明，抗藥性可以較穩(wěn)定的遺傳給后代，抗多菌靈基因?qū)γ舾谢蚴秋@性的。木霉菌株可以通過原生質(zhì)體融合進行抗藥性性狀改良。 2抗藥性生防木霉菌發(fā)酵新工藝及新型制劑加工2.1抗藥性生防木霉菌THY7發(fā)酵工藝研究證明，抗藥性木霉菌株THY7可以采用半開放式發(fā)酵工藝，也可以采取開放式發(fā)酵工藝。 抗藥性生防木霉菌株TYH7采用“半開放式固體發(fā)酵法”的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基質(zhì)為小麥麩皮和玉米秸稈(1：4)，細度為60～100目，含水量為65

7、％(W/W)左右，120℃滅菌30min；發(fā)酵接種量為每100g培養(yǎng)基質(zhì)接種10mL孢子懸浮液，濃度為1×107cfu/mL；發(fā)酵溫度26℃；發(fā)酵環(huán)境相對濕度90％以上；發(fā)酵7～10d即可停止，風(fēng)干后儲存。每克發(fā)酵產(chǎn)物孢子量可達1.4×1010～1.5×1010個。 抗藥性生防木霉菌株TYH7采用“開放式固體發(fā)酵法”的發(fā)酵條件為：按照每1千克小麥麩皮和玉米秸稈的混合物(1：4)，細度為60～100目，加入3種藥劑的混合藥液200

8、0mL(含有多菌靈50mg/L、咪鮮胺50mg/L、農(nóng)用鏈霉素200mg/L)；培養(yǎng)基質(zhì)含水量為65％(W/W)左右；發(fā)酵接種量為每100g培養(yǎng)基質(zhì)接種10mL孢子懸浮液，濃度為1×108cfu/mL；發(fā)酵溫度26℃；發(fā)酵環(huán)境相對濕度90％以上；發(fā)酵10～12d即可停止，風(fēng)干后儲存。每克發(fā)酵產(chǎn)物孢子量可達1.5×1010～1.7×1010個。與半開放式固體發(fā)酵相比，可以減少復(fù)雜的滅菌處理和無菌接種，大大降低發(fā)酵成本，為抗藥性木霉菌株TH

9、Y7的工業(yè)化生產(chǎn)提供了全新而又簡便的發(fā)酵工藝路線。 2.2抗藥性生防木霉菌THY7新制劑加工技術(shù)表面活性劑是木霉制劑加工過程中使用的重要助劑。研究結(jié)果表明，常用的表面活性劑對木霉菌株孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響存在很大差異。陰離子類型的乳化分散劑500＃對抗性和敏感菌株都有顯著影響，分散劑NNO對敏感菌株的抑制作用很大，EC50值只有2.2515mg/L，而抗性菌株則很安全，EC50值大于4000mg/L；非離子類型的乳化劑對木霉菌

10、株大都很安全(如700＃)，從理論上明確了常用助劑對木霉制劑加工的影響，在國內(nèi)外尚未見報道，對木霉制劑加工選擇合適助劑有重要的指導(dǎo)意義。 根據(jù)抗性生防木霉菌株THY7的來源特點，結(jié)合自主研制的保護劑Prv-1對孢子在水中儲存的良好保護作用，研制出“伴侶式”木霉新型制劑，常溫下(5～35℃)存放2年，孢子的存活率達90％以上。開辟了生防木霉菌制劑加工的新途徑，對加工生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義，在國內(nèi)外尚未見報道。 不同粉碎氣流壓

11、力對木霉固體發(fā)酵物粉碎結(jié)果證明，在0.8MPa的粉碎壓力下，木霉孢子的存活率只有17.4％，氣流粉碎技術(shù)不適合木霉固體發(fā)酵制劑的粉碎。木霉可濕性粉劑的加工應(yīng)采取“分離式”加工技術(shù)。為木霉可濕性粉劑的加工探索出另一條新路子，有較高的應(yīng)用價值，該加工配方和加工工藝國內(nèi)外尚未見報道。 2.3抗藥性生防木霉制劑與化學(xué)殺菌劑的聯(lián)合作用通過防治番茄灰霉病試驗證明，抗藥性木霉菌THY7對灰霉病菌(Bortrytiscinerea)具有良好的生