Toll樣受體4對急性胰腺炎相關性腎損傷的影響.pdf

1、急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上常見的急腹癥之一，特別是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）并發(fā)癥多，預后兇險，病死率可高達30％～40％。SAP時腎功能障礙大約為14％～43％，發(fā)展至急性腎功能衰竭（ARF）后死亡率可高達71％～84％，為臨床SAP病人死亡的重要原因之一。
　　 Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）是天然免

2、疫系統(tǒng)識別病原微生物的主要受體，可以特異性的識別病原微生物，偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導途徑，并激活天然免疫細胞，最終導致一系列的免疫炎癥反應。TLR4廣泛分布于動物和人體的肝、肺、心、腎及胰腺等組織中。TLR4是介導細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）信號跨膜轉(zhuǎn)導的主要受體，對于革蘭氏陰性菌的感染性炎癥至關重要。我們通過觀察AP大鼠腎臟TLR4的表達變化，了解TLR4對急性胰腺炎相關性腎臟損傷中的影響，并提供一種新的治療思路。<

3、br>　　 目的：
　　 觀察TLR4在急性胰腺炎小鼠腎臟的表達，并應用TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）干預，探討TLR4對急性胰腺炎相關性腎損傷的影響，為急性胰腺炎腎損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、動物模型的制備：選取雄性wistar大鼠，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中作切口進入腹腔，用4號加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/min速度注入5％牛

4、磺膽酸鈉（0.1 ml/100g），推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處，觀察3 min，剪除除結(jié)扎線，關腹。
　　 2、實驗分組：將雄性wistar大鼠18只，隨機分為假手術組（SO組，n=6）、急性胰腺炎組（AP組，n=6）、TLR4單克隆抗體治療組（TLR4mAb組，n=6），后者于造模后立即經(jīng)腹腔注射TLR4mAb50μg/只，于注藥8小時處死大鼠，留取血液和組織血標本，進行相關項目的檢測。
　　 3、生化指標測定：取血

5、清樣本，采用全自動血清生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮，由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生化室協(xié)助測定。
　　 4、胰腺、腎組織病理學：采用石蠟切片，HE染色。
　　 5、免疫組織化學法測定腎組織TLR4、NF-kBp65表達：脫蠟至水，抗原熱修復后，用3％過氧化氫孵育15 min。封閉一抗4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min，后用3，3-二氨基苯聯(lián)胺（DAB）顯色，復染后封片。以細胞

6、漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達，并進行免疫組化評分。
　　 6、western blot法測定腎組織TLR4、NF-kBp65表達：取100mg腎組織經(jīng)勻漿器徹底粉碎，加入1ml細胞裂解液，充分裂解，提取TLR4膜蛋白（具體操作按說明書），取20μg與上樣緩沖液充分混合，置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，以5％的脫脂奶粉封閉，一抗（1：250）4℃孵育過夜，以相應的二抗室溫下孵育2h，抗體檢測按Santa Cruz公

7、司試劑盒說明書進行。
　　 結(jié)果：
　　 1、胰腺病理學：在SO組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)始終大致正常；AP組胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死，伴有炎癥細胞浸潤，腹水也增多。而TLR4mAb組較AP組的損傷較輕。
　　 2、腎臟病理學：在SO組腎組織結(jié)構(gòu)始終大致正常；AP組腎組織水腫、充血，炎細胞聚集；而TLR4mAb組較AP組的腎組織結(jié)構(gòu)損傷相對較輕。
　　 3、血清淀粉酶、脂肪酶測定：在SO組正常。與SO組比

8、較，在AP組及TLR4mAb組均顯著升高（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組血清淀粉酶降低（P<0.05）。
　　 4、血清肌酐、尿素氮變化：在SO組正常。與SO組比較，在AP組和TLR4mAb組均顯著升高（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組血清肌酐、尿素氮降低（P<0.05）。
　　 5、免疫組化法測定腎組織TLR4和NF-kBp65表達
　　 TLR4表達：在SO組腎組織TLR4有弱的

9、表達。AP組，在血管內(nèi)皮細胞，腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)均有明顯增強的TLR4表達，免疫組化評分顯示TLR4mAb組表達強度低于AP組（P<0.05）。
　　 NF-kBp65表達：在SO組腎組織NF-kBp65的表達量較少。在AP組腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)即見大量細胞核呈棕褐色染色的陽性細胞，在TLR4mAb組表達強度低于AP組（P<0.05）。
　　 6、western blot法測定腎組織TLR4和NF-kBp65

10、>　　 TLR4蛋白表達：密度掃描分析顯示，在SO組腎組織有弱的TLR4表達，在AP組和TLR4mAb組均有明顯增強（P<0.05）。與AP組比較，在TLR4mAb組表達減弱（P<0.05）。
　　 NF-kBp65蛋白表達：密度掃描分析顯示，在SO組腎組織有弱的NF-kBp65表達。在AP組與TLR4mA-b組NF-kBp65表達均明顯增強（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組NF-kBp65表達減弱。
　　

11、 結(jié)論：
　　 1、對大鼠逆行膽胰管內(nèi)注射5％牛磺膽酸鈉，檢測血清淀粉酶、脂肪酶水平升高，血清肌酐、尿素氮升高，胰腺和腎組織HE染色觀察到胰腺及腎周圍組織水腫、出血和壞死，炎細胞浸潤等表現(xiàn)，證實大鼠AP存在不同程度的腎損傷。
　　 2、在AP大鼠腎組織中，TLR4和NF-κB表達均明顯增加，TLR4作為炎癥反應的閘門，可能與AP時腎損傷的發(fā)生發(fā)展有關。
　　 3、應用TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）能改善大