Toll樣受體4對(duì)急性胰腺炎相關(guān)性腎損傷的影響.pdf

1、急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上常見的急腹癥之一，特別是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）并發(fā)癥多，預(yù)后兇險(xiǎn)，病死率可高達(dá)30％～40％。SAP時(shí)腎功能障礙大約為14％～43％，發(fā)展至急性腎功能衰竭（ARF）后死亡率可高達(dá)71％～84％，為臨床SAP病人死亡的重要原因之一。
　　 Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）是天然免

2、疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體，可以特異性的識(shí)別病原微生物，偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并激活天然免疫細(xì)胞，最終導(dǎo)致一系列的免疫炎癥反應(yīng)。TLR4廣泛分布于動(dòng)物和人體的肝、肺、心、腎及胰腺等組織中。TLR4是介導(dǎo)細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，對(duì)于革蘭氏陰性菌的感染性炎癥至關(guān)重要。我們通過觀察AP大鼠腎臟TLR4的表達(dá)變化，了解TLR4對(duì)急性胰腺炎相關(guān)性腎臟損傷中的影響，并提供一種新的治療思路。<

3、br>　　 目的：
　　 觀察TLR4在急性胰腺炎小鼠腎臟的表達(dá)，并應(yīng)用TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）干預(yù)，探討TLR4對(duì)急性胰腺炎相關(guān)性腎損傷的影響，為急性胰腺炎腎損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、動(dòng)物模型的制備：選取雄性wistar大鼠，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中作切口進(jìn)入腹腔，用4號(hào)加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/min速度注入5％牛

4、磺膽酸鈉（0.1 ml/100g），推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處，觀察3 min，剪除除結(jié)扎線，關(guān)腹。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組：將雄性wistar大鼠18只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=6）、急性胰腺炎組（AP組，n=6）、TLR4單克隆抗體治療組（TLR4mAb組，n=6），后者于造模后立即經(jīng)腹腔注射TLR4mAb50μg/只，于注藥8小時(shí)處死大鼠，留取血液和組織血標(biāo)本，進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)。
　　 3、生化指標(biāo)測(cè)定：取血

5、清樣本，采用全自動(dòng)血清生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室協(xié)助測(cè)定。
　　 4、胰腺、腎組織病理學(xué)：采用石蠟切片，HE染色。
　　 5、免疫組織化學(xué)法測(cè)定腎組織TLR4、NF-kBp65表達(dá)：脫蠟至水，抗原熱修復(fù)后，用3％過氧化氫孵育15 min。封閉一抗4℃過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min，后用3，3-二氨基苯聯(lián)胺（DAB）顯色，復(fù)染后封片。以細(xì)胞

6、漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達(dá)，并進(jìn)行免疫組化評(píng)分。
　　 6、western blot法測(cè)定腎組織TLR4、NF-kBp65表達(dá)：取100mg腎組織經(jīng)勻漿器徹底粉碎，加入1ml細(xì)胞裂解液，充分裂解，提取TLR4膜蛋白（具體操作按說明書），取20μg與上樣緩沖液充分混合，置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，以5％的脫脂奶粉封閉，一抗（1：250）4℃孵育過夜，以相應(yīng)的二抗室溫下孵育2h，抗體檢測(cè)按Santa Cruz公

7、司試劑盒說明書進(jìn)行。
　　 結(jié)果：
　　 1、胰腺病理學(xué)：在SO組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)始終大致正常；AP組胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腹水也增多。而TLR4mAb組較AP組的損傷較輕。
　　 2、腎臟病理學(xué)：在SO組腎組織結(jié)構(gòu)始終大致正常；AP組腎組織水腫、充血，炎細(xì)胞聚集；而TLR4mAb組較AP組的腎組織結(jié)構(gòu)損傷相對(duì)較輕。
　　 3、血清淀粉酶、脂肪酶測(cè)定：在SO組正常。與SO組比

8、較，在AP組及TLR4mAb組均顯著升高（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組血清淀粉酶降低（P<0.05）。
　　 4、血清肌酐、尿素氮變化：在SO組正常。與SO組比較，在AP組和TLR4mAb組均顯著升高（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組血清肌酐、尿素氮降低（P<0.05）。
　　 5、免疫組化法測(cè)定腎組織TLR4和NF-kBp65表達(dá)
　　 TLR4表達(dá)：在SO組腎組織TLR4有弱的

9、表達(dá)。AP組，在血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)均有明顯增強(qiáng)的TLR4表達(dá)，免疫組化評(píng)分顯示TLR4mAb組表達(dá)強(qiáng)度低于AP組（P<0.05）。
　　 NF-kBp65表達(dá)：在SO組腎組織NF-kBp65的表達(dá)量較少。在AP組腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)即見大量細(xì)胞核呈棕褐色染色的陽性細(xì)胞，在TLR4mAb組表達(dá)強(qiáng)度低于AP組（P<0.05）。
　　 6、western blot法測(cè)定腎組織TLR4和NF-kBp65

10、>　　 TLR4蛋白表達(dá)：密度掃描分析顯示，在SO組腎組織有弱的TLR4表達(dá)，在AP組和TLR4mAb組均有明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與AP組比較，在TLR4mAb組表達(dá)減弱（P<0.05）。
　　 NF-kBp65蛋白表達(dá)：密度掃描分析顯示，在SO組腎組織有弱的NF-kBp65表達(dá)。在AP組與TLR4mA-b組NF-kBp65表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與AP組比較，TLR4mAb組NF-kBp65表達(dá)減弱。
　　

11、 結(jié)論：
　　 1、對(duì)大鼠逆行膽胰管內(nèi)注射5％?；悄懰徕c，檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶水平升高，血清肌酐、尿素氮升高，胰腺和腎組織HE染色觀察到胰腺及腎周圍組織水腫、出血和壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)，證實(shí)大鼠AP存在不同程度的腎損傷。
　　 2、在AP大鼠腎組織中，TLR4和NF-κB表達(dá)均明顯增加，TLR4作為炎癥反應(yīng)的閘門，可能與AP時(shí)腎損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　 3、應(yīng)用TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）能改善大