脂聯(lián)素與兔髂動脈球囊損傷后內膜增殖的關系及羅格列酮的干預作用.pdf

1、經(jīng)皮腔內冠狀動脈成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）是近年來治療冠狀動脈狹窄的理想手段，但術后較高的再狹窄發(fā)生率嚴重影響了其遠期療效，給病人乃至社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔。但PTCA術后再狹窄發(fā)生的具體機制，迄今仍原理不明。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是新近發(fā)現(xiàn)的一種功能多樣的脂肪因子，已被證實有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎、胰島素增敏等方面的作用，但

2、其在預防PTCA術后再狹窄中的作用尚不明了。 現(xiàn)有研究結果表明，APN在體內的表達受多種因素調節(jié)，噻唑烷二酮類（thiazolidinedions，TZDs）藥物是就是其中比較典型的一種，它能通過激動特異性的過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）γ來增加體內APN的表達水平。TZDs類藥物羅格列酮可通過與體內受體結合后激活，從而明顯改善Ⅱ型糖尿

3、病患者的胰島素抵抗、高胰島素血癥和高糖血癥代謝紊亂，與此同時，此類藥物在降血壓、調節(jié)脂質代謝、抑制炎癥反應、抗動脈粥樣硬化以及對腎臟的保護方面也顯示了較好的作用。對其在減輕血管內皮損傷后再狹窄方面的作用進行深入的研究并明確其與APN等脂肪因子之間的聯(lián)系，將有利于指導我們的臨床工作，為解決再狹窄這一難題提供新的思路，并將為糖尿病、脂肪代謝紊亂、心血管疾病之間的聯(lián)系提供新的證據(jù)。 目的: 1、觀察APN與兔髂動脈球囊內膜損傷

4、術后血管內膜增殖水平及超敏C反應蛋白（high-sensitivity C-responsibility protein，hs-CRP）等心血管炎性標志物表達的關系，并進行相關性分析以明確APN在血管內膜損傷術后再狹窄中所起的作用。 2、明確特異性的PPAR-γ激動劑羅格列酮是否可以通過提高兔體內APN的表達水平等途徑保護受損的血管內皮，抑制血管內膜平滑肌細胞的過度增殖，探討羅格列酮參與血管再狹窄的可能機制。 3、了解羅

5、格列酮對實驗兔高脂飲食加髂動脈血管內膜剝脫術后血糖、血脂及hs-CRP等指標的影響。 方法: 1、實驗動物的選取及分組3月齡的健康雄性新西蘭大耳白兔30只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組各10只，即假手術對照組（給予普通飲食+單純右側股動脈結扎術）、模型組（給予高脂飲食+球囊內膜剝脫術）和羅格列酮組（給予高脂飲食+球囊內膜剝脫術+羅格列酮）。后兩組首先給予高脂飼料（普通飼料中加入1%膽固醇、7．5%蛋黃粉和8%豬油）喂養(yǎng)8

6、周后，行右側髂動脈球囊內膜剝脫手術。 2、髂動脈球囊內膜損傷模型的建立速麻安（0．1-0．15ml/kg）肌肉注射進行麻醉，常規(guī)備皮，消毒鋪巾，于右側大腿內側膝上股動脈搏動最明顯處縱行切開皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉，游離股動脈2-3cm，結扎遠心端，近心端用無創(chuàng)血管夾暫時夾閉。用眼科剪在結扎動脈稍上方作一個約45°的切口，切口勿大于血管管徑的1/2，直接插入動脈導管鞘，依次送入導絲針和軟頭導絲，沿導絲送入2．5F冠狀動脈球囊導

7、管，深度約12-15cm，達髂動脈分叉水平，以8個大氣壓充盈球囊，將充氣球囊沿髂動脈上下牽拉5-8cm至股動脈近端，反復3次，充分剝離髂動脈內膜，然后抽空球囊移出導管，結扎血管，分層縫合切口。術后肌注青霉素80萬單位抗感染，連續(xù)3天。羅格列酮組從實驗前3天開始增加羅格列酮0．5mg/kg/d，混在第1口飼料中給藥。 3、血清標本指標檢測分別于實驗初和手術后第1、4周末經(jīng)耳緣靜脈采血，標本采集前實驗動物禁食8小時，標本收集后立即送

8、本院檢驗科，使用全自動生化測定儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血糖（FPG）和超敏C反應蛋白（hs-CRP）的含量。同時用ELISA法測定血漿中脂聯(lián)素的表達水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。 4、組織學分析分別于術后第1、4周末隨機采用空氣栓塞法處死各組實驗動物各5只，剖開腹腔，游離腹主動脈并逆行分離至髂總動脈，插管用生理鹽水灌洗腹-髂動脈。

9、以左、右髂動脈分叉點為參照，留取病理標本各1～2cm，放入10%中性甲醛中固定，制作石蠟切片，行HE染色及彈力纖維染色。每個標本隨機選取5個視野，應用高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定血管新生內膜面積（IA）、中膜面積（MA），并計算內膜增殖指數(shù)，內膜增殖指數(shù)=IA/（IA+MA）。行免疫組化染色檢測增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，具體檢測步驟參照試劑盒說明書進行。陽性著色均表現(xiàn)為胞核成棕黃色，隨機選取5個視野，計算陽性表達率（陽性細胞數(shù)

10、/觀察細胞總數(shù)，%）。 5、凋亡細胞結果檢測根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明，鏡下觀察著色的陽性細胞，每張切片取5個視野（×400），計數(shù)正常細胞和陽性細胞，細胞凋亡率=平均陽性染色細胞核數(shù)/所有細胞核數(shù)×100%。 6、統(tǒng)計學處理以SPSS13．0統(tǒng)計軟件包進行分析，計量資料用X±S表示，兩組資料間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間差異的顯著性分析用方差分析，P<0．05有統(tǒng)計學意義。制表、攝片描述實驗結果。 結果:

11、 1、羅格列酮對血脂及APN表達的影響各組血脂、血糖的基礎水平差異均無統(tǒng)計學意義（P≥0．05）。術后第1周、4周末模型組和羅格列酮組兔血清TC、TG、LDL-C和hs-CRP的水平均顯著高于正常對照組（P<0．01或P<0．05）。羅格列酮組較模型組上述指標顯著下降（術后l周末時TC：P=0．000、TG：P=0．028、LDL-C：P=0．000；術后4周末時TC：P=0．001、TG：P=0．001、LDL-C：P=0．00

12、0），但各組間HDL-C的變化不明顯，血糖的差異無顯著性（P>0．05）。正常對照組、模型組和羅格列酮組血漿APN的基礎水平無統(tǒng)計學差異（依次為2．29±0．23、2．32±0．28和2．35±0．36ug/ml，P>0．05），術后1周末模型組及羅格列酮組APN水平均有所降低，模型組下降更為顯著，但兩組間的差別不顯著（分別為1．44±0．31和1．62±0．63ug/ml，P=0，191）；第4周末，模型組APN的水平繼續(xù)下降，而羅格

13、列酮組則有所回升，兩組相比差異有顯著性（分別為1．17±0．33和1．85±0．16 ug/ml，P=0．01），提示羅格列酮干預4周可以顯著提高兔體內APN的表達水平。 2、APN與球囊損傷后兔血管內膜增殖水平的關系實驗結果表明，高脂飲食加髂動脈球囊內膜損傷術后，隨著血清TC、TG和LDL-C水平的增高，APN的表達水平是顯著降低的，APN水平與血管內膜的增值指數(shù)IHI呈顯著的負相關，以術后4周末更為顯著（r=-0．733，P

14、=0．002），與血管炎性指標hs-CRP呈顯著的負相關（r=-0．860，P=0．000），提示APN參與了模型組動物的血脂代謝紊亂及內膜增殖等病理生理過程。 3、血管形態(tài)學改變：HE染色及彈力纖維染色可見對照組血管內膜光滑，中膜平滑肌細胞環(huán)繞管腔排列規(guī)則；模型組內膜明顯增厚，管腔狹窄，內膜及中膜下平滑肌細胞增生且不規(guī)則，彈力纖維層增粗、紊亂，斑塊隆起明顯，可見大量泡沫細胞浸潤。以上病理變化術后4周末較1周末更為顯著。羅格列酮

15、組內膜、中膜亦有不同程度的增厚，管腔有一定狹窄，但狹窄程度同模型組相比差異有顯著性（P<0．01或P<0．05）。 4、PCNA表達的免疫組化染色及細胞凋亡檢測染色結果顯示，PCNA陽性表達細胞胞核呈棕黃色，主要集中在新生內膜中。對照組少見PCNA的陽性表達，而模型組與羅格列酮干預組均可見PCNA有不同程度的表達。與模型組相比，羅格列酮干預后PCNA表達明顯下降（術后1周末P=0．000，術后4周末P=0．000）。凋亡細胞的核

16、為棕褐色，正常對照組少見凋亡細胞，球囊損傷后細胞凋亡增多，成散在分布，以增生的血管內膜多見。羅格列酮干預后細胞凋亡數(shù)目較模型組明顯增多，1、4周末模型組與羅格列酮組分別為21．84±3．22比36．25±3．79，P=0．000；18．64±1．28比24．79±2．48，P=0．000），隨著時間的延長，術后4周末較1周末細胞凋亡程度有減輕的趨勢。 結論: 兔髂動脈球囊損傷后血漿脂聯(lián)素的水平與內膜增殖程度呈顯著的負相關