四逆湯對(duì)兔髂動(dòng)脈球囊損傷后血管狹窄的作用及機(jī)制研究.pdf

1、自首例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)獲得成功以來，隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，操作技術(shù)的提高以及氣囊導(dǎo)管和造影設(shè)備的不斷改進(jìn)，PTCA的成功率顯著提高。然而PTCA后冠狀動(dòng)脈早期再狹窄(RS)的發(fā)生率多年來無明顯降低，高達(dá)25％～35％，少數(shù)達(dá)50％，已成為影響其治療效果的主要因素，也是近年來臨床和實(shí)驗(yàn)室研究極為關(guān)注的課題。 人類PTCA術(shù)后RS病變的發(fā)生過程中，血管內(nèi)膜增殖和血管重塑起著非常重要的作用，另外血栓形成、炎性反應(yīng)、

2、免疫反應(yīng)和感染等因素也起著一定的作用，還與許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、血管和血細(xì)胞成分相互作用有關(guān)。一般認(rèn)為，RS過程是一個(gè)血管損傷后新生內(nèi)膜增生與血管重構(gòu)的過程。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌，促進(jìn)外膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化重要因子，TGF-β1參與血管損傷后內(nèi)膜增殖和負(fù)性血管重塑，在PTCA術(shù)后RS病理過程中起到重要作用。 一氧化氮(NO)是由正常內(nèi)皮細(xì)

3、胞NO合酶(NOS)以L-精氨酸(L-Arg)為底物合成和釋放的舒張因子，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，NO的持續(xù)釋放，能減少基礎(chǔ)和刺激后平滑肌細(xì)胞(SMC)的遷移，在多個(gè)環(huán)節(jié)抑制RS的形成。 氧化應(yīng)激對(duì)血管損傷后的RS起重要作用，抑制氧化應(yīng)激可能對(duì)血管損傷后的RS起抑制作用。 應(yīng)用阿司匹林、普通肝素、低分子肝素等藥物治療PTCA后RS均無明顯療效，而血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑、他汀類藥物

4、等效果也不盡如人意，冠脈內(nèi)放置支架在一定程度預(yù)防了術(shù)后RS，但本身作為異物，可致血栓形成和異物反應(yīng)。涂層支架仍有許多問題需要解決如價(jià)格昂貴難以大規(guī)模推廣，基因治療尚有許多理論、技術(shù)、倫理等方面的問題需要解決，短時(shí)間內(nèi)難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床，因此尋找一種能夠有效防治PTCA術(shù)后RS的藥物是目前冠脈介入治療的當(dāng)務(wù)之急。 四逆湯(SND)出自《傷寒論》，由附子、干姜、甘草三味藥組成，現(xiàn)代大量動(dòng)物和藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)四逆湯具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞功能、改善冠脈循環(huán)、抗實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化等多種作用，我們推測(cè)其可能在防治PTCA術(shù)后RS方面起重要作用。 本課題的目的是通過球囊損傷兔髂動(dòng)脈造成動(dòng)脈損傷的動(dòng)物模型，觀察中藥四逆湯對(duì)損傷后動(dòng)脈內(nèi)膜的保護(hù)和修復(fù)作用，以及對(duì)TGF-β1和NO系統(tǒng)的影響，探討四逆湯對(duì)兔髂動(dòng)脈球囊損傷后狹窄的防治作用及其可能機(jī)制，為四逆湯用于臨床防治PTCA術(shù)后RS提供理論依據(jù)。 材料與方法 雄性新西蘭大白兔24只，兔齡4月，體

6、重2.56±0.24Kg，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、四逆湯治療組(四逆湯組)，每組8只，對(duì)照組兔予普通飼料，模型組、四逆湯組兔予以高脂飲食(膽固醇1.0％，豬油10％，余為普通飼料)。飼養(yǎng)2周后模型組、四逆湯組兔行髂動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)，對(duì)照組兔行假手術(shù)。術(shù)后四周處死各組實(shí)驗(yàn)兔，留取血清檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TG

7、F-β1、NO、NOS水平；剪取球囊損傷側(cè)髂動(dòng)脈，經(jīng)中性甲醛固定后分別行HE染色觀察血管內(nèi)膜增生情況，通過免疫組化檢查觀察TGFβ-1和eNOS蛋白在血管壁的表達(dá)，圖像分析儀分析染色結(jié)果；留取部分髂動(dòng)脈通過透射電鏡觀察髂動(dòng)脈的超微結(jié)構(gòu)的變化，掃描電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞排列和結(jié)構(gòu)；留取部分髂動(dòng)脈采用RT-PCR方法檢測(cè)血管壁TGF-β1和eNOSmRNA的表達(dá)。 結(jié)果 對(duì)照組兔于喂養(yǎng)14天時(shí)自然死亡1只，模型組兔于術(shù)后第10天死

8、亡1只，四逆湯組兔于術(shù)后第2天死亡1只。所以，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組各有動(dòng)物7只。 1、四逆湯對(duì)兔髂動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響：掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組兔髂動(dòng)脈內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；而模型組兔髂動(dòng)脈可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)皮細(xì)胞增生形態(tài)各異，內(nèi)皮下膠原纖維暴露；而四逆湯組內(nèi)皮細(xì)胞排列基本正常； 透射電鏡發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組兔髂動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)層次清晰，內(nèi)皮完整，無泡沫細(xì)胞；模型組可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，大量泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞游走；四逆湯組內(nèi)皮細(xì)

9、胞基本正常，泡沫細(xì)胞較少； 光鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組兔髂動(dòng)脈管腔和管壁厚度正常，管壁光滑；模型組與對(duì)照組相比，管壁明顯增厚、管腔明顯狹窄，內(nèi)膜增厚，可見巨大動(dòng)脈硬化斑；而治療組管壁增厚較輕，管腔狹窄較輕，內(nèi)膜增厚程度減輕；圖象分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組兔髂動(dòng)脈內(nèi)膜厚度明顯大于四逆湯組和對(duì)照組(P＜0.05)，模型組兔髂動(dòng)脈管腔面積明顯小于四逆湯組和對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)果顯示四逆湯具有促進(jìn)血管損傷后的修復(fù)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的

10、發(fā)展，防止血管狹窄的作用。 2、四逆湯對(duì)兔血清脂質(zhì)的影響：四逆湯組兔血清TC、TG和LDL-C明顯高于對(duì)照組，但是低于模型組，而且四逆湯組兔血清HDL-C明顯高于對(duì)照組和模型組，說明四逆湯可有效的調(diào)節(jié)血脂。 3、四逆湯對(duì)兔血清SOD活性和MDA水平的影響：對(duì)照組兔血清SOD活性明顯高于四逆湯組和模型組，治療組SOD活性又明顯高于模型組(P＜0.05)。而對(duì)照組兔血清MDA水平明顯低于四逆湯組和模型組，四逆湯組MDA水平又

11、明顯低于模型組(P＜0.05)。結(jié)果提示四逆湯可提高SOD的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。 4、四逆湯對(duì)兔TGF-β1的影響：對(duì)照組兔血清TGF-β1水平明顯低于模型組和四逆湯組，四逆湯組又明顯低于模型組(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組兔髂動(dòng)脈內(nèi)膜TGF-β1的分布稀疏，而模型組TGFβ-1的染色面積明顯大于對(duì)照組(P＜0.05)，四逆湯組TGF-β1的染色面積明顯小于模型組(P＜0.05)。模型組TGF-β1的染色灰度明顯

12、大于對(duì)照組(P＜0.05)，四逆湯組TGF-β1的染色灰度明顯小于模型組(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示在對(duì)照組兔髂動(dòng)脈有少量TGF-β1mRNA表達(dá)，模型組TGF-β1mRNA表達(dá)明顯增加，而四逆湯組TGF-β1mRNA的表達(dá)比模型組明顯減少，與模型組有顯著性差異(P＜0.05)。 5、四逆湯對(duì)兔NO系統(tǒng)的影響：本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組兔血清NO水平明顯低于對(duì)照組和四逆湯組，P＜0.05；四逆湯組與對(duì)照組相比無顯著性差異，P

13、＞0.05；模型組兔血清總NOS活性明顯低于對(duì)照組和四逆湯組，P＜0.05；四逆湯組與對(duì)照組相比無顯著性差異，P＞0.05；免疫組化示三組動(dòng)物內(nèi)膜均有eNOs蛋白表達(dá)，模型組eNOs和四逆湯組蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱(P＜0.05)，四逆湯組eNOs蛋白表達(dá)比模型組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。三組動(dòng)物內(nèi)膜內(nèi)有eNOSmRNA表達(dá)，模型組和四逆湯組eNOSmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱(P＜0.05)，四逆湯組較模型組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)