大豆種子貯藏蛋白亞基特異種質的篩選、鑒定及其遺傳穩(wěn)定性與功能性研究.pdf

1、本研究以1400份大豆品種為材料，在篩選到蛋白亞基特異種質的基礎上，進行了亞基含量年份問穩(wěn)定性分析、亞基缺失類型的進一步鑒定和遺傳分析以及種質創(chuàng)新、亞基特異種質的蛋白功能性評價等方面的研究。以期為進一步發(fā)掘我國豐富的大豆基因資源、篩選出亞基組成優(yōu)良的大豆材料，明確亞基變異類型遺傳規(guī)律，闡明亞基變異對大豆蛋白功能性的影響奠定基礎。主要結果如下： 1、1400份參試品種的11S／7S比值范圍為0.44～3.64，平均值為1.68±0

2、.37，鑒定出34份亞基含量特異材料，其中包括α′和α亞基含量低、β亞基含量低、A<,3>B<,4>亞基缺失、A<,5>A,,4>B<,3>亞基缺失和A<,1a>B<,1b>亞基缺失種質。理化誘變結果表明：化學誘變率為2.92％，物理誘變率為5.71％，對大豆蛋白的誘變效果0.4％EMS處理優(yōu)于0.2％EMS處理，而<'60>Co γ射線慢照射處理優(yōu)于化學誘變處理。并從M<,3>代種子中篩選出了211粒亞基變異種質。 2、分析了

3、2003年、2004年和2005年種植的280份大豆種質的7s和11S組分及其亞基含量間的差異，結果表明：品種對大豆貯藏蛋白7S、11S組分及其亞基含量、7S+11S和11S／7S值的影響均達極顯著水平，年份除對α亞基和A<,4>亞基含量的影響達極顯著水平外，對其它亞基含量及7S、11S、7S+11S和11S／7S值的影響均不顯著；品種×年份對7S、11S、11S／7S值、α亞基、A<,4>亞基和A<,5>亞基含量的影響達極顯著水平，對

4、其它組分和亞基含量的影響均不顯著。 3、在SDS-PAGE篩選到蛋白亞基特異種質的基礎上，運用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)分析大豆貯藏亞基正常品種南農大黃豆和亞基變異品種桂陽紫金豆種子總蛋白的蛋白質組。差異蛋白質組學顯示，等電點和分子量分別約為5.40和37.85 kDa、5.24和37.2 kDa、5.15和37.05 kDa的蛋白質點在正常品種種子中表達而在缺失品種中未表達。對這3個蛋白質點用基質輔助激光解析電離飛行時

5、間質譜(MALDI-TOF-MS)測定其膠內酶解后的肽質量指紋譜(PMF)，對獲得的PMF用Mascot軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢比對，鑒定出這3個蛋白質點均為大豆球蛋白A<,1a>B<,1b>亞基同源三聚體，表明桂陽紫金豆種子貯藏蛋白缺少A<,1a>b<,1b>亞基。 4、研究了4個不同蛋白亞基類型(A<,1a>B<,1b>亞基正常、A<,1a>B<,1b>亞基缺失； A<,3>B<,4>亞基正常、A<,3>B<,4>亞基缺

6、失)的品種所配成的6個雜交組合的F<,1>、F<,2>、F<,3>種子亞基表現(xiàn)及其遺傳。結果表明：A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基正常分別受一對顯性基因控制，A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基缺失分別受一對隱性基因控制，控制A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基正常的基因分別對控制A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基缺失的基因均表現(xiàn)為完全顯性，其F<,2>的分離

7、均符合3：1的遺傳比例。同時，利用聚合雜交方法，在缺失A<,1a>B<,1b>亞基、A<,23>B<,4>亞基和A<,5>A<,4>B<,3>亞基單株間及其分離后代間進行雜交，經SDS-PAGE檢測表明：獲得了5份缺失A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基和A<,5>A<,4>B<,3>亞基的創(chuàng)新種質。5、為明確提取分離大豆貯藏蛋白11S和7S兩種主要組分的最適方法，采用凱氏定氮和SDS-PAGE分析，從浸提液種類、提取

8、液pH值、浸提次數(shù)和溫度、料液比、Tris-HC1濃度和還原劑種類等影響提取分離效果的因素著手，綜合Nagano法和Thanh法兩者的優(yōu)點，對提取分離方法進行了進一步的改進。結果表明：浸提液采用pH8.5、含0.01m01／L亞硫酸氫鈉的0.03～0.06m01／L Tris-HCl緩沖液系統(tǒng)，提取溫度45℃，料液比1:15，重復浸提兩次；分離過程中，在pH6.4沉淀離心分離出11S組分、調pH5.5沉淀離心分離出中間產物后，再調pH值

9、至4.8沉淀離心分離出7S組分。優(yōu)化后的方法顯著提高了11S和7S組分的得率、蛋白含量和純度。 6、以5個具遺傳穩(wěn)定性的蛋白亞基變異類型大豆品種(系)制備的分離蛋白和南農大黃豆粗7S蛋白為材料，對其溶解性、凝膠質構特性、乳化性和乳化穩(wěn)定性以及DSC特性進行了測定。結果表明：在溶解性方面，11S組分單個亞基缺失對大豆蛋白的溶解性沒有顯著影響。在凝膠質構特性方面，A<,3>B<,4>亞基缺失、11S組分含量顯著降低對凝膠質構特性影響

10、顯著；7S組分含量與凝膠彈性呈顯著正相關；11S組分含量與凝膠硬度、膠粘性和破裂強度呈顯著正相關，與凝膠內聚性呈極顯著正相關，與凝膠彈性呈極顯著負相關；11S／7S值與凝膠硬度、內聚性和膠粘性均呈顯著正相關，與凝膠彈性呈極顯著負相關。在乳化性和乳化穩(wěn)定性方面，11S組分單個亞基缺失對乳化性和乳化穩(wěn)定性影響不顯著，11S組分含量顯著降低或缺失對乳化性和乳化穩(wěn)定性影響顯著。在熱穩(wěn)定性方面，粗7S蛋白和M11SR所制分離蛋白變性溫度和變性焓較