中慢生型天山根瘤菌luxI類AHL合成酶基因的鑒定、表達(dá)及對共生結(jié)瘤的影響.pdf

1、根瘤菌可以在豆科植物根部形成根瘤從而固氮空氣中的N<,2>，這其中包括了一系列不同的信號傳導(dǎo)過程。在許多根瘤茵中發(fā)現(xiàn)LuxR-LuxI類群體感應(yīng)是其中重要的調(diào)節(jié)因素之一，如調(diào)控結(jié)瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)生和固氮效率等。但目前對生長速度介于快生和慢生之間的中慢生型屬根瘤菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)還沒有確切的報(bào)道。本文將中慢生型屬八個(gè)種的模式菌株培養(yǎng)至高細(xì)胞密度，對培養(yǎng)上清進(jìn)行了乙酸乙酯的萃取抽提，應(yīng)用高效檢測菌株JZAl對其中的AHL分子

2、進(jìn)行了TLC分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中慢生型屬八種模式茵產(chǎn)生AHL信號分子的能力和類別有很大的差異性。其中可以在甘草等至少八種不同的豆科植物根部結(jié)瘤的中慢生型天山根瘤菌CCBAU 3306產(chǎn)生的AHL信號分子種類最多(八種)。對中慢生型天山根瘤菌進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，其培養(yǎng)上清中AHL的產(chǎn)生活性具有典型的依賴細(xì)胞密度的特征，即在低細(xì)胞濃度時(shí)產(chǎn)生較低的AHL活性，高細(xì)胞濃度時(shí)則產(chǎn)生較高的AHL活性。其后AHL活性降低則是由于在茵體生長后期pH值升高而

3、導(dǎo)致了AHL分子的堿水解作用。 為了鑒定M.tianshanense中負(fù)責(zé)產(chǎn)生AHL分子的基因，在高拷貝質(zhì)粒pEZSeq-Kan中構(gòu)建了M.tianshanense的基因文庫并電轉(zhuǎn)化至E.coli中進(jìn)行表達(dá)。采用了一種簡單新穎的篩選方法快速的從基因文庫細(xì)胞中篩選獲得了3株可以產(chǎn)生較高AHL活性的陽性克隆。對這3株陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析確定pHMZ9B1中含有的插入片斷最大，其測序結(jié)果表明，pHMZ9B1中的外源插入片斷中含有406lb

4、p堿基，該插入片斷中含有一個(gè)665bp的ORF和一個(gè)在其上游大小為819bp的ORF，經(jīng)balst分析，確定與其它幾種LuxI和LuxR型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有不同的同源性，因此分別被定名為MrtI和MrtR。為了驗(yàn)證在E.coli庫細(xì)胞中篩選鑒定得到的LuxI同源物MrtI在m．tianshanense中是否確實(shí)產(chǎn)生AHL信號分子，將mrtI側(cè)翼區(qū)進(jìn)行overlapping PCR并克隆至sacB自殺性質(zhì)粒載體pWM91中，與野生型菌株接

5、合后進(jìn)行同源基因的雙交換篩選獲得了mrtI完全突變?nèi)笔е?。對mrtI突變株的培養(yǎng)上清進(jìn)行液體活性和TLC分析均未檢測到AHL活性。而MrtI/MrtR區(qū)域在E.coli中可以表達(dá)至少6種不同的AHL分子。同時(shí)對新的M.tian-shanense基因文庫進(jìn)行了重復(fù)的篩選均未發(fā)現(xiàn)不同于mrtI的自體誘導(dǎo)物合成酶基因，因此在M.tianshanense中MrtI負(fù)責(zé)了合成所有的AHLs分子。為了研究M.tianshanense中AHL合成酶基

6、因mrtI的表達(dá)情況，PCR擴(kuò)增mrtI基因的中間片斷并克隆至pVIK112中，與野生型菌株的mrtI，區(qū)域進(jìn)行同源交換后獲得了mrtI-lacZ融合表達(dá)菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該群體感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因mrtI呈自體誘導(dǎo)的方式，只有在具有很高AHLs活性的野生型菌株的上清存在的情況下mrtI才能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，而沒有AHL活性的mrtI突變株的上清并不能誘導(dǎo)mrtI的表達(dá)。與野生型菌株相比，M.tianshanense的mrtI群體感應(yīng)突變菌株在其宿