中慢生華癸根瘤菌群體感應系統(tǒng)自體誘導物合成相關基因的篩選、鑒定及對共生結(jié)瘤的影響.pdf

1、根瘤菌可以在豆科植物根部形成根瘤從而固定空氣中的N2，這其中包括了一系列不同的信號傳導過程。在許多根瘤菌中發(fā)現(xiàn)LuxR-LuxI類群體感應是其中重要的信號傳遞系統(tǒng)之一，它能調(diào)控根瘤菌許多生理功能例如結(jié)瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)生和固氮效率等。 利用本實驗室所構(gòu)建的高效檢測菌JZA1在中慢生華癸根瘤菌Mesorhizobium huakuii As9中檢測到自體誘導物分子的存在，定量的β-半乳糖苷酶活性檢測與定性的反向薄層

2、層析檢測表明該菌株可以產(chǎn)生較高活性的自體誘導物分子。 為了研究該群體感應系統(tǒng)，本實驗通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座子文庫的方法，成功地篩選到了兩株不產(chǎn)生自體誘導物的突變株YQ1和YQ2。兩突變株自體誘導物活性與野生型相比都明顯降低。為了確定突變株中轉(zhuǎn)座子的插入位點，運用了任意PCR(arbitrary PCR)的方法得到了轉(zhuǎn)座子兩端的基因序列。結(jié)果顯示：突變株YQ1中轉(zhuǎn)座子插入一個639bp的ORF內(nèi)部，經(jīng)BlastX分析，它所編碼的212個氨基

3、酸與Mesorhizobium loti MAFF303099中AHL合成酶mrl5638同源性高達99％，將其命名為mrhI；突變株YQ2中轉(zhuǎn)座子插入一個732bp的ORF之上，經(jīng)BlastX分析，它與Mesorhizobium loti MAFF303099中調(diào)節(jié)蛋白mrl5637同源性高達97％。 為了研究Mesorhizobium huakuii As9中AHL合成酶基因mrhI的表達情況，PCR擴增mrhI基因的中間片

4、斷并克隆至pVIK112中，與野生型菌株的mrhI區(qū)域進行同源交換后獲得了mrhI-lacZ融合表達菌株YQ3。在菌株YQ3的培養(yǎng)液中加入不同濃度菌株YQO的培養(yǎng)物上清液，待菌體生長到對數(shù)生長期，對菌體直接進行β-半乳糖苷酶活性檢測，結(jié)果顯示，隨著外源上清液濃度增加，lacZ的活性也隨著增高，群體感應調(diào)節(jié)蛋白基因mrhI呈自體誘導的方式，只有在具有高活性AHLs的野生型菌株上清液存在時mrhI才能夠被誘導表達，而mrhI突變株的上清液并

5、不能誘導mrhI的表達.這說明mrhI的表達是受其自身合成的信號因子AHLs分子的調(diào)控。 結(jié)瘤試驗顯示：接種根瘤菌16天后，接種野生型和接種突變株的植株根部均能觀察到結(jié)瘤現(xiàn)象，但與野生型菌株相比，接種突變菌株的紫云英植株所結(jié)瘤的數(shù)目比野生型少。這說明突變菌株對其寄主植物紫云英的結(jié)瘤能力有一定的影響，在Mesorhizobium huakuii As9與宿主植物的共生過程中，群體感應發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用，但確切的作用機制目前尚不清