華癸中慢生根瘤菌ctrA突變體構建及其宿主互作蛋白初步篩選.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、ctrA在α-變形細菌中普遍存在,是細菌分裂周期和不對稱分化的調控因子,在雙組分調控系統(tǒng)中充當應答調節(jié)子。類菌體的發(fā)育也涉及到根瘤菌的分裂分化過程,分析認為ctrA基因可能參與根瘤菌類菌體分化或共生固氮,亦可能接受宿主植物來源的控制作用。但是相關的研究報道和文獻很少。
   本實驗通過構建同源雙交換置換載體pJQ200SK-ctrA,試圖直接篩選華癸中慢生根瘤菌7653R ctrA基因插入失活突變體。但是一直未能獲得預期的突變體

2、,考慮到ctrA基因可能存在突變致死性,本研究調整了篩選路線和策略,重新構建了ctrA滲漏表達載體pHN-ctrA和雙交換質粒,為后續(xù)篩選目標突變體奠定了基礎條件。
   另外一方面,通過構建組成型表達載體pBBR-ctrA,通過接合轉移技術,將額外拷貝的ctrA引入華癸根瘤菌7653R中,觀察根瘤菌自生條件和共生條件下的生長情況。結果發(fā)現(xiàn)其不影響7653R在自生培養(yǎng)時的生長;但是其共生表型為結瘤數(shù)量減少、固氮酶活性有所降低。熒

3、光定量PCR檢測ctrA表達量,結果表明:ctrA在自生和共生條件下呈組成型表達特點,且在不同時期根瘤中其表達水平差異不明顯。引入額外組成型拷貝ctrA可導致根瘤中的表達量稍增強。
   同時,以構建pGBKT7-ctrA質粒作為誘餌,通過酵母雙雜交技術,篩選前期已構建的紫云英AD-cDNA文庫。最終結果獲得4個陽性克隆,其中包括一個JUN激酶激活域結合蛋白。
   最后,基于ctrA box序列的保守性,本文對于華癸根

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