濕邪內(nèi)蘊證模型大鼠的治療作用研究.pdf

1、目的:
　　在中醫(yī)理論指導下,探討大鼠濕邪內(nèi)蘊證模型的造模過程及檢測方法,為中醫(yī)證型動物造模方法提供理論依據(jù)。并研究加味達原飲對D-GalN及CCL4所致的濕邪內(nèi)蘊證急性肝損傷實驗動物模型的治療效果及作用機制。為中醫(yī)治療急性肝損傷提供科學依據(jù)。
　　方法:
　　選擇加味達原飲對D-GalN及CCL4所致的濕邪內(nèi)蘊證急性肝損傷大鼠模型進行干預,檢測生化、免疫、病理、細胞通路等指標,研究達原飲治療濕邪內(nèi)蘊證肝損傷大鼠的機制

2、及療效。
　　實驗一濕邪內(nèi)蘊證動物模型的建立
　　SD大鼠,雌性,36只,隨機分為空白對照組組、模型1組、模型2組,每組12只。模型1組使用“常規(guī)飲食+造模箱”造模。將大鼠置于溫度28±2℃,濕度為90±5％的造模箱內(nèi)飼養(yǎng)15天。造模2組使用“高脂高糖飲食+造模箱”造模。將大鼠置于溫度28±2℃,濕度為90±5%的造模箱內(nèi)飼養(yǎng)15天,并同時予高脂高糖飲食。測量大鼠的飲食量、飲水量、體重、SOD、MDA。
　　實驗二加味

3、達原飲治療D-GalN所致急性肝損傷濕邪內(nèi)蘊證大鼠的研究
　　SD大鼠,雌性,72只,隨機分為空白對照組、模型組、陽性(美能)組、加味達原飲低、中、高劑量組,每組12只。除空白對照組外,余各組大鼠置于溫度28±2℃,濕度90%±5%的造模箱內(nèi)飼養(yǎng)15天,并同時給予高脂高糖飲食,15天后一次性腹腔注射D-GalN500mg/kg以造成急性肝損傷模型,造模后立即給予藥物灌胃治療,每日兩次,其中陽性(美能)組的日給藥量為15.75mg/

4、kg/天,加味達原飲低、中、高劑量組的日給藥量分別為:5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌藥體積為每次10ml/kg/次。造模48h后,所有大鼠股動脈采血,取血漿測ALT、AST、TB,ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6,肝組織勻漿后熒光PCR法檢測NF-КB有關信號傳導通路的p65、p50蛋白的表達。處死動物,取肝右葉作常規(guī)HE切片,光鏡下觀察其變化。
　　實驗三加味達原飲治療CC

5、L4所致急性肝損傷濕邪內(nèi)蘊證大鼠的研究
　　SD大鼠,雌性,72只,隨機分為空白對照組、模型組、陽性(美能)組、加味達原飲低、中、高劑量組,每組12只。除空白對照組外,余各組大鼠置于溫度28±2℃,濕度90%±5%的造模箱內(nèi)飼養(yǎng)15天,并同時給予高脂高糖飲食,15天后一次性腹腔注射CCL4原液1ml/kg體重以造成急性肝損傷模型,造模后立即給予藥物灌胃治療,每日兩次,其中陽性(美能)組的日給藥量為15.75mg/kg/天,加味達原

6、飲低、中、高劑量組的日給藥量分別為:5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌藥體積為每次10ml/kg。造模48h后,所有大鼠股動脈采血,取血漿測ALT、AST、TB,比色法檢測SOD、MDA,ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6,肝組織勻漿后熒光PCR法檢測NF-КB相關信號傳導通路的p65、p50蛋白的表達。處死動物,取肝右葉作常規(guī)HE切片,光鏡下觀察其變化。
　　結(jié)果:
　　1

7、.濕熱內(nèi)蘊證動物模型的造模結(jié)果
　　造模后15天,模型1組飲食量、體重有明顯的下降,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。飲水量與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SOD、MDA與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型2組大鼠的飲食量、飲水量、體重、SOD明顯下降,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDA明顯升高,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。<

8、br>　　2.加味達原飲對D-GalN所致急性肝損傷濕邪內(nèi)蘊證大鼠的治療作用
　　(1)造模后48h,模型組ALT、AST、TB含量明顯升高,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組,達原飲中、高劑量組ALT、AST、TB降低,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);加味達原飲低劑量組ALT下降,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　(2)造模后48h,模型組血漿TNF-α

9、、IL-1、IL-6含量明顯增高,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組、加味達原飲中、高劑量治療組血漿TNF-α、IL-1、IL-6明顯降低,與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組的TNF-α、IL-1、IL-6含量有所下降,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　(3)NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA檢測結(jié)果:模型組NF-κBp50,NF-κBp65 m

10、RNA的表達明顯增高,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組、加味達原飲中、高劑量治療組NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表達明顯降低,與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表達與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　(4)肝組織HE染色檢測結(jié)果顯示:空白對照組肝竇肝索結(jié)構(gòu)清楚,肝細胞胞質(zhì)豐富,核大而圓。模型組肝細胞片

11、狀壞死,或碎屑狀壞死,肝細胞濁腫。加味達原飲低劑量組肝細胞廣泛水腫,可見點狀壞死和小灶區(qū)脂肪變性和點狀肝細胞再生。陽性(美能)組,加味達原飲中、高劑量組肝細胞廣泛濁腫,可見點狀壞死。脂肪變性不明顯。
　　3.加味達原飲對CCL4所致急性肝損傷濕邪內(nèi)蘊證大鼠的治療作用
　　(1)造模后48h,模型組ALT、AST、TB含量明顯升高,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組,加味達原飲中、高劑量組ALT

12、、AST、TB降低,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);加味達原飲低劑量組ALT下降,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(2)造模后48h,模型組SOD降低,MDA升高,與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組、加味達原飲中、高劑量組的SOD升高,MDA下降,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);加味達原飲低劑量組SOD升高,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.0

13、5)。
　　(3)造模后48h,模型組血漿TNF-α、IL-1、IL-6含量明顯增高,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。加味達原飲中、高劑量組的TNF-α下降,與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組、加味達原飲高劑量組IL-6下降,與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(4)NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA檢測結(jié)果:模型組NF-κBp50,NF-κBp65 mR

14、NA的表達明顯增高,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性(美能)組、加味達原飲中、高劑量治療組NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表達明顯降低,與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表達與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　(5)肝組織HE染色檢測結(jié)果顯示:空白對照組肝竇肝索結(jié)構(gòu)清楚,肝細胞胞質(zhì)豐富,核大而圓。模型組肝細胞點狀

15、壞死,有廣泛的肝細胞水腫,明顯脂肪變性。加味達原飲低劑量組可見肝細胞部分水腫,脂肪變性和灶區(qū)肝細胞再生。陽性(美能)組,加味達原飲中、高劑量組見肝細胞水腫,點狀肝細胞再生,肝細胞脂肪變性較模型組輕。
　　結(jié)論
　　1.“高脂高糖飲食+造模箱”和“常規(guī)飲食+造模箱”都可造成濕邪內(nèi)蘊證動物模型。且造成的大鼠模型偏于濕熱內(nèi)蘊證。造模后大鼠的行動、體重、飲食量、飲水量都有明顯改變。但“高脂高糖飲食+造模箱”造模方法的效果更顯著,造模

16、后大鼠不僅一般表現(xiàn)發(fā)生明顯改變,且測量后顯示SOD、MDA發(fā)生改變。這與中醫(yī)的內(nèi)外因致病的理論相一致。
　　2.加味達原飲中、高劑量治療組均能顯著減輕D-GalN所致濕邪內(nèi)蘊證大鼠的肝細胞損傷,降低血漿中ALT、AST、TB含量,具有較好的保肝降酶作用。加味達原飲中、高劑量治療組能顯著改善急性肝損傷濕邪內(nèi)蘊證大鼠肝組織的病理變化,縮小病變面積,減輕肝細胞病變程度。并可降低機體一系列的細胞因子,通過調(diào)節(jié)機體的免疫反應而起到保肝作用。

17、加味達原飲低劑量組也有一定的保肝降酶作用,但其各指標結(jié)果之間差異較大,效果較難評價。
　　3.加味達原飲的中、高劑量組可明顯減輕CCL4所致濕邪內(nèi)蘊證大鼠的肝細胞損傷,降低血漿中ALT、AST、TB含量,具有較好的保肝降酶作用。并可對SOD、MDA及TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子起到調(diào)節(jié)作用,并可調(diào)節(jié)NF-κBp50,NF-κBp65的表達,通過抑制機體的脂質(zhì)過氧化反應、免疫調(diào)節(jié)等多重功效而發(fā)揮保肝作用。加味達原飲低劑量