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文檔簡(jiǎn)介
1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性自身免疫性疾病,其免疫系統(tǒng)活躍,產(chǎn)生大量自身抗體并對(duì)多系統(tǒng)多器官造成損害。共刺激分子如CD70-CD27和CD154-CD40對(duì)于B細(xì)胞的活化起著重要作用。SEL患者CD4+T淋巴細(xì)胞過(guò)度表達(dá)CD70、CD11a、Perforin、CD40 ligand,這些基因的調(diào)控序列的CpGs存在異常低甲基化。由于DNA是與組蛋白一起共同有序地存在于細(xì)胞核中,因此DNA甲基化與組蛋白修飾可能存在相互影響。目前關(guān)于
2、SLE組蛋白修飾的研究甚少。我們的前期研究結(jié)果顯示,SLE患者存在基因組CD4+T細(xì)胞存在H3和H4低乙?;约癏3K9低甲基化。然而,特定基因的組蛋白修飾與基因組總體組蛋白修飾可能不一致。因此,我們對(duì)編碼CD70的TNFSF7這一特定基因調(diào)控序列組蛋白修飾進(jìn)行研究。用5-azaC(一種DNMTs抑制劑)處理的正常CD4+T細(xì)胞和SLE患者CD4+T細(xì)胞都過(guò)度表達(dá)CD70,其TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域都存在低甲基化。所以,本課題將研究SLE
3、患者CD4+T細(xì)胞CD70mRNA表達(dá)、TNFSF7基因調(diào)控序列組蛋白修飾、甲基化CpG結(jié)合蛋白水平及其相互關(guān)系,以及對(duì)正常CD4+T細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳十預(yù)后對(duì)該基因表達(dá)以及組蛋白修飾、甲基化CpG結(jié)合蛋白水平的影響。 第一部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞CD70(TNFSF7)啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾和甲基化CpG結(jié)合蛋白異常的研究 目的:表觀遺傳學(xué)兩大主要修飾方式--DNA甲基化和組蛋白修飾,在基因調(diào)控中起重要作用。系
4、統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)T細(xì)胞過(guò)度表達(dá)共刺激分子CD70可激活B細(xì)胞過(guò)度活化和產(chǎn)生大量自身抗體。SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70基因調(diào)控序列存在低甲基化,但其甲基化CpG結(jié)合蛋白以及組蛋白修飾的情況未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要探討SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70編碼基因TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域核心組蛋白H3、H4的乙?;虷3K4、H3K27的甲基化狀態(tài)以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 方法:22例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者
5、均來(lái)自我院門診和住院病人,活動(dòng)性患者11例,其中男2例,女8例,年齡17~39歲,平均年齡28.73±6.45歲,平均SLEDAI評(píng)分11.09±3.65分,非活動(dòng)性患者11例,其中男2例,女8例,年齡19~53歲,平均年齡34.27±9.96歲,平均SLEDAI評(píng)分2.18±1.89分。正常對(duì)照組9例,男3例,女6例,年齡23~40歲,平均28.5±5.2歲,均為本院健康醫(yī)務(wù)人員。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠分離外
6、周血CD4+T細(xì)胞,染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法柃測(cè)TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙?;约癏3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞CD70mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05),且與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)呈正相關(guān)(R=0.561,P<0.05);啟動(dòng)子區(qū)
7、域組蛋白H3呈高乙?;癄顟B(tài)(P=0.008),且H3乙?;脚c疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)(R=0.765,P<0.01);H3K4二甲基化水平顯著增高(P=0.011),也與疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)(R=0.66,P<0.05);三甲基化H3K27下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)。此外,我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞該啟動(dòng)子區(qū)域MeCP2結(jié)合量明顯降低(P=0.038)。 結(jié)論:TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修
8、飾如核心組蛋白H3高乙?;?、H3K4高甲基化以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MeCP2減少可能在SLECD4+T細(xì)胞CD70過(guò)表達(dá)中起重要作用。 第二部分表觀遺傳干預(yù)對(duì)正常CD4+T細(xì)胞CD70(TNFSF7)基因表達(dá)以及組蛋白修飾影響的研究 目的:探討DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5-azaC)、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素(TSA)單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)對(duì)正常CD4+T細(xì)胞CD70表達(dá)的影響,以及對(duì)TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域組
9、蛋白核心組蛋白H3/H4的乙?;虷3K4、H3K27的甲基化狀態(tài)以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平的影響。 方法:采用密度梯度離心法分離正常外周血單個(gè)核細(xì)胞,用PHA刺激培養(yǎng)16-24小時(shí)后,加免疫磁珠分離CD4+T細(xì)胞,分別給予5-azaC、TSA單獨(dú)處理培養(yǎng)或聯(lián)合培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后收集細(xì)胞,用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法檢測(cè)TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3/H
10、4乙?;约癏3K4二甲基化、H3K27三甲基化水平以及甲基化CpG結(jié)合蛋白MBD2、MeCP2的結(jié)合水平。 結(jié)果:5-azaC和TSA單獨(dú)或聯(lián)合處理都能顯著增加CD4+T細(xì)胞CD70mRNA的表達(dá)(P<0.05)。5-azaC單獨(dú)處理能顯著增加TNFSF7啟動(dòng)子區(qū)域H3K4二甲基化水平(P=0.016),降低MeCP2的結(jié)合水平(P=0.035);TSA單獨(dú)處理能顯著增加組蛋白H3、H4乙?;约癏3K4二甲基化水平(P<0.
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