巴氏新小綏螨高溫品系篩選及其適應(yīng)性機(jī)制研究.pdf

1、植綏螨是一類具有捕食能力的螨類，利用植綏螨控制農(nóng)業(yè)害蟲害螨是有害生物綠色防控的一項(xiàng)重要措施。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，多數(shù)農(nóng)業(yè)害螨，如二斑葉螨Tetranychus urticae、柑橘全爪螨Panonychus citri、山楂葉螨T. viennensis等為高溫活動(dòng)型葉螨，適度高溫環(huán)境會(huì)加重該類型葉螨的發(fā)生與危害，而植綏螨對(duì)高溫環(huán)境相對(duì)敏感，且商業(yè)化植綏螨大多是在25°C恒溫條件下飼養(yǎng)獲得。我國(guó)長(zhǎng)江中下游和西南、華南地區(qū)，夏季6-8月日均

2、溫高于30°C的高溫天數(shù)可能持續(xù)十幾天甚至數(shù)十天，商業(yè)化植綏螨釋放到田間后，即使在獵物相當(dāng)充足的狀況下，植綏螨種群數(shù)量仍增長(zhǎng)較慢而失去對(duì)害螨的控制作用。同時(shí)全球氣候變暖、極端天氣頻繁發(fā)生也是制約植綏螨在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中持續(xù)控制害螨、發(fā)揮其生物防治效能的重要因素。因此，如何提高商業(yè)化植綏螨天敵產(chǎn)品的耐熱性，使其在高溫環(huán)境下仍具有高效、持續(xù)控制害蟲害螨潛能，已成為當(dāng)前利用植綏螨進(jìn)行生物防治時(shí)最需要迫切解決的科技問題。本研究主要內(nèi)容包括：

3、>　　⑴商業(yè)化植綏螨多系為最適溫區(qū)飼養(yǎng)、繁殖與規(guī)?；a(chǎn)。本學(xué)位論文將恒溫25°C環(huán)境中飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨N. barkeri實(shí)驗(yàn)種群視為常溫品系（CS），該品系亦可被視為商業(yè)化品系（CS）。為篩選獲得巴氏新小綏螨N. barkeri高溫品系（HTAS），本學(xué)位論文設(shè)定了“高溫鍛煉—高溫馴化—高溫再鍛煉—高溫再馴化”的長(zhǎng)期篩選模式。巴氏新小綏螨N. barkeri長(zhǎng)期高溫馴化飼養(yǎng)溫度為35°C；高溫鍛煉過程，即每馴化飼養(yǎng)15?20 d后

4、于45°C暴露1次，每次暴露約24h。截止到本學(xué)位論文開展試驗(yàn)測(cè)定生物生態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及分子生物學(xué)等適應(yīng)性評(píng)價(jià)時(shí)，巴氏新小綏螨N. barkeri共獲得高溫鍛煉次數(shù)至少為25次，高溫馴化天數(shù)近450d（約110代左右）。巴氏新小綏螨N. barkeri經(jīng)過長(zhǎng)期高溫馴化和高溫鍛煉，對(duì)短時(shí)高溫脅迫的承受能力顯著增強(qiáng)。因卵殼的保護(hù)作用，巴氏新小綏螨N. barkeri卵有較強(qiáng)的高溫耐受能力，常溫品系和高溫品系卵在經(jīng)歷短時(shí)高溫脅迫后，其孵化率差

5、異不顯著；兩種品系雌成螨高溫致死率均隨脅迫強(qiáng)度的增加（溫度和暴露時(shí)間）而顯著升高，但高溫品系在極端溫度環(huán)境中的存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于常溫品系（如45°C時(shí)：HTAS LT50=15.2 h遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于CS LT50=1.9 h）。戶外高溫?zé)崂吮┞?h后，高溫品系雌成螨死亡率亦低于常溫品系雌成螨死亡率。巴氏新小綏螨N. barkeri具有非常明顯的溫度可塑性和適應(yīng)性。常溫品系在35°C環(huán)境中能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育、交配和繁殖，但其適合度相比室溫25°C環(huán)

6、境明顯降低，主要表現(xiàn)為發(fā)育加快（1.63 d，占27.0%）、總產(chǎn)卵量降低（42.5粒/雌，占64.0%）和平均壽命縮短（29.7d，占57.2%），且未成熟期死亡率增大（27.0%，占29.3%）。高溫品系無論是在室溫25°C還是在高溫35°C環(huán)境中，其發(fā)育速率均變快；25°C時(shí)，總產(chǎn)卵量和平均壽命與常溫品系無顯著差異，暗示著巴氏新小綏螨N. barkeri高溫品系在室溫環(huán)境中亦能發(fā)揮較大生殖潛能，但在高溫35°C環(huán)境中，總產(chǎn)卵量顯著

7、低于常溫品系，說明高溫品系中存在明顯的生殖與存活權(quán)衡機(jī)制。此外，長(zhǎng)期高溫飼養(yǎng)還可導(dǎo)致雌性比例降低（15.1%，占21.0%）?？傮w來講，巴氏新小綏螨N. barkeri在中等高溫環(huán)境中主要是以降低繁殖水平來?yè)Q取存活空間。根據(jù)高溫敏感性測(cè)定結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬了短時(shí)高溫事件（分別在38°C和42°C處理了2 h和4 h，以室溫25°C未經(jīng)脅迫處理為對(duì)照），分批次對(duì)巴氏新小綏螨N. barkeri雌成螨（羽化后1?2 d）進(jìn)行了高溫處理，并

8、對(duì)其存活情況和生殖特性予以評(píng)價(jià)（允許雌成螨與同齡雄成螨（未經(jīng)脅迫處理）進(jìn)行多次交配以獲得最大產(chǎn)卵量）。結(jié)果表明，巴氏新小綏螨 N. barkeri常溫品系雌成螨經(jīng)過短時(shí)高溫脅迫處理后，產(chǎn)卵前期顯著延長(zhǎng)、總產(chǎn)卵量顯著下降、平均壽命顯著縮短，且隨脅迫強(qiáng)度的增加而變得愈加明顯；高溫品系雌成螨產(chǎn)卵前期亦延長(zhǎng)，總產(chǎn)卵量降低，但雌成螨平均壽命并未受到影響，且在42°C脅迫處理組中（2 h和4 h），高溫品系雌成螨平均壽命顯著長(zhǎng)于常溫品系平均壽命。為

9、明確巴氏新小綏螨N. barkeri對(duì)二斑葉螨T. urticae潛在控制能力是否受高溫脅迫效應(yīng)的影響，試驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)脅迫溫度處理（38°C和42°C，以25°C為對(duì)照）和2個(gè)脅迫時(shí)間處理（2 h和4 h），分別對(duì)兩種品系雌成螨事先進(jìn)行高溫脅迫處理，在室溫（25°C）環(huán)境中研究了巴氏新小綏螨N. barkeri雌成螨對(duì)二斑葉螨T. urticae若螨的捕食功能反應(yīng)。無論巴氏新小綏螨N. barkeri經(jīng)歷高溫脅迫與否，兩種品系雌成螨對(duì)二

10、斑葉螨T. urticae若螨捕食功能反應(yīng)均為Holling II型。高溫脅迫后，常溫品系雌成螨對(duì)二斑葉螨T. urticae若螨捕食量（24 h）與對(duì)照相比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，瞬時(shí)攻擊率（a）降低，處理時(shí)間（Th）延長(zhǎng)，對(duì)獵物控制能力（a/Th）降低，但均未隨脅迫強(qiáng)度而呈現(xiàn)規(guī)律性變化。高溫品系雌成螨對(duì)二斑葉螨T. urticae若螨的捕食功能反應(yīng)并不受高溫脅迫的影響。高溫脅迫可能對(duì)巴氏新小綏螨N. barkeri食欲產(chǎn)生負(fù)面影響，短期內(nèi)出現(xiàn)

11、厭食反應(yīng)，但隨室溫恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)其捕食功能可能會(huì)逐漸得到恢復(fù)。
　?、瓢褪闲滦〗楎寡趸磻?yīng)研究。溫度脅迫能夠打破巴氏新小綏螨N. barkeri細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，發(fā)生氧化脅迫。雌成螨在低溫0°C和5°C、高溫38°C和42°C環(huán)境中分別脅迫2 h和4 h，以25°C為對(duì)照，測(cè)定了巴氏新小綏螨N. barkeri兩種溫度品系雌成螨的抗氧化反應(yīng)水平。研究結(jié)果表明，高溫品系雌成螨細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽

12、-硫-轉(zhuǎn)移酶GSTs和總抗氧化能力T-AOC活性均顯著低于常溫品系，脂質(zhì)過氧化水平亦低于后者，說明抗氧化酶系統(tǒng)可能參與了巴氏新小綏螨 N. barkeri高溫馴化反應(yīng)。當(dāng)遭遇高溫脅迫后，兩種品系 SOD、CAT、POD以及GSTs活性均顯著增強(qiáng)，暗示著這些抗氧化酶可能以一種協(xié)同作用的方式共同參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化過程；隨脅迫強(qiáng)度的增加，如42°C處理4 h后，雌成螨體內(nèi)MDA含量升高且達(dá)到最大值，暗示了抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧ROS能力有限，導(dǎo)

13、致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度較高，甚至引起個(gè)體死亡。低溫脅迫（0°C）能誘導(dǎo)SOD等4種抗氧化酶活性上調(diào)表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，但MDA含量?jī)H在高溫品系雌成螨體內(nèi)累積，說明高溫品系可能對(duì)低溫脅迫較為敏感，脂質(zhì)過氧化程度較高。綜合分析表明，巴氏新小綏螨N. barkeri在高溫馴化過程中可能會(huì)盡量選擇降低能量消耗，通過協(xié)同多種抗氧化酶以應(yīng)對(duì)溫度脅迫。
　?、前褪闲滦〗楎齼煞N品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較與分析?；贗llumina HiSeq?

14、2000平臺(tái)對(duì)巴氏新小綏螨N. barkeri常溫品系和高溫品系兩個(gè)樣本進(jìn)行全螨態(tài)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得42,917,214和43,537,230個(gè)clean reads，經(jīng)過組裝后獲得52,776條Unigenes，分別在nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了比對(duì)注釋，共有36,951條Unigenes在上述5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋，注釋率為70%。通過對(duì)nr數(shù)據(jù)庫(kù)中成功注釋的 Unigene同源性分析，發(fā)現(xiàn)有52.

15、9%的基因與其近緣物種西方盲走螨 Metaseialus occdentalis相似。巴氏新小綏螨N. barkeri經(jīng)過高溫馴化，其基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)了新的重組，有多達(dá)10506條Unigenes表達(dá)量發(fā)生顯著性變化，約占總數(shù)的1/5，其中有6,338條Unigenes上調(diào)，4,168條Unigenes下調(diào)，說明高溫環(huán)境中基因表達(dá)發(fā)生了適應(yīng)性改變，相當(dāng)多的基因顯著上調(diào)/下調(diào)表達(dá)。
　?、劝褪闲滦〗楎裏峒さ鞍譎SPs mR

16、NA表達(dá)模式解析。從巴氏新小綏螨 N. barkeri轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了5條與熱激蛋白基因相關(guān)的 HSPs Unigenes，分別是 CL1558.Contig1_All、Unigene13225_All、 CL4607.Contig1_All、Unigene8871_All、Unigene861_All，通過Blastn序列比對(duì)，最終確定目的基因序列分別為Hsp90、Hsp75、Hsp70、Hsp60和Hsp40。使用在線引物設(shè)計(jì)軟

17、件Primer3（http://bioinfo.ut.ee/primer3/），設(shè)計(jì)以上5個(gè)HSPs基因的RT-qPCR引物，以Beta actin基因作為參考基因。采用RT-qPCR技術(shù)，首先明確了巴氏新小綏螨N. barkeri5種HSPs基因在不同發(fā)育階段中的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常溫品系與高溫品系HSPs mRNA相對(duì)表達(dá)量均在各自不同發(fā)育階段中均存在顯著性差異。Hsp90 mRNA在常溫品系卵期和成螨階段表達(dá)量較高，但在

18、高溫品系若螨和雌成螨體內(nèi)表達(dá)量較高；Hsp75 mRNA分別在常溫品系雌成螨和高溫品系若螨體內(nèi)表達(dá)量較高；Hsp60 mRNA在常溫品系若螨及成螨體內(nèi)表達(dá)量較低，而在高溫品系卵和雄成螨體內(nèi)表達(dá)量較低。熱激蛋白HSPs（Hsp90 mRNA和Hsp60 mRNA）在高溫品系中發(fā)生差異性表達(dá)（相較于常溫品系），暗示了這些 HSPs蛋白在高溫品系馴化飼養(yǎng)過程中可能發(fā)揮了重要的生理功能。Hsp70和Hsp40作為生物體內(nèi)最為重要分子伴侶蛋白，其

19、表達(dá)量在兩種品系中均隨發(fā)育階段而呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。其次明確了高溫脅迫溫度（分別在38°C和42°C中處理1 h）對(duì)巴氏新小綏螨N. barkeri兩種品系5種HSPs mRNA表達(dá)模式的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫能誘導(dǎo)巴氏新小綏螨N. barkeri Hsp90 mRNA、Hsp75 mRNA、Hsp70 mRNA、Hsp60 mRNA和Hsp40 mRNA在各發(fā)育階段內(nèi)的上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)模式具有明顯的溫度效應(yīng)，即在42°C中暴露1

20、h時(shí)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著，例如常溫品系Hsp70 mRNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上調(diào)倍數(shù)分別達(dá)1258.6倍、2443.9倍、269.4倍、135.2倍和42.9倍，高溫品系Hsp70 mRNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上調(diào)倍數(shù)分別達(dá)1739.2倍、1478.9倍、215.5倍、159.9倍和45.9倍。最后明確了高溫脅迫時(shí)間（42°C中處理1 h、2 h、3h和4 h）對(duì)巴氏新小綏螨N. barkeri雌成螨5種H

21、SPs mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，常溫品系Hsp70 mRNA和Hsp40 mRNA在脅迫1 h后表達(dá)量顯著上調(diào)表達(dá)，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐步恢復(fù)至正常水平/略高于正常水平；當(dāng)脅迫時(shí)間大于等于3h時(shí)，高溫品系雌成螨 Hsp70 mRNA和Hsp40mRNA表達(dá)量顯著高于常溫品系，說明Hsp70和Hsp40蛋白在高溫品系抵御高溫中起到保護(hù)作用。巴氏新小綏螨N.barkeri雌成螨Hsp90 mRNA和Hsp60 mRNA在高溫脅迫