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文檔簡介
1、巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri(Hughes)隸屬于植綏螨科Phytoseiidae新小綏螨屬Neoseiulus。巴氏新小綏螨是諸多吸汁性農(nóng)業(yè)害蟲的重要捕食性天敵,在農(nóng)林作物生物防治應用方面,具有較廣的應用前景和極其重要的應用價值。前期研究證實在基礎飼料中添加氨基酸對腐食酪螨(替代獵物)和巴氏新小綏螨發(fā)育進度、繁殖力、抗逆性、捕食功能等均有影響。鑒于此,本論文研究了亮氨酸、組氨酸2種氨基酸添加對巴氏新小綏螨的抗逆性及
2、捕食功能的影響,進一步構(gòu)建了巴氏新小綏螨的轉(zhuǎn)錄組測序文庫,并進行了轉(zhuǎn)錄組測序,對未添加與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨間顯差異表達基因進行了分析,最后對巴氏新小綏螨體內(nèi)3個熱激蛋白基因(Heat shock proteins,Hsps)進行序列分析,并對其誘導表達模式進行了研究。本研究結(jié)果對巴氏新小綏螨規(guī)?;?、高效人工繁殖及提高其田間適應性及防治效果有一定的指導意義,也可為了解Hsps在巴氏新小綏螨抗高溫逆境脅迫中的分子機制,為天敵的分子
3、改造提供理論基礎。主要研究結(jié)論如下:
1.氨基酸營養(yǎng)添加能延長巴氏新小綏螨的耐饑時間、提高巴氏新小綏螨的耐高溫能力以及捕食能力。在25℃飼養(yǎng)環(huán)境中,巴氏新小綏螨雌成螨喂養(yǎng)腐食酪螨的條件下,其群體存活率為50%時,添加亮氨酸的飼養(yǎng)組耐饑時間最長,添加組氨酸的飼養(yǎng)組次之,未添加氨基酸的對照組耐饑時間最短,說明添加氨基酸能延長巴氏新小綏螨的耐饑時間;在40℃高溫下處理10h,經(jīng)亮氨酸和組氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨的存活率相比未添加氨基酸
4、對照組分別提高了56.00%和26.00%,說明添加氨基酸能夠提高巴氏新小綏螨的耐高溫能力;添加氨基酸飼養(yǎng)后的巴氏新小綏螨的捕食能力和最大日捕食量都有一定的變化,其中相比于未經(jīng)氨基酸添加飼養(yǎng)的對照組,亮氨酸、組氨酸添加飼養(yǎng)后的巴氏新小綏螨的捕食能力有所提高,亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨捕食能力相對提高了17.08%,組氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨的捕食能力相對提高了31.82%。添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨對腐食酪螨的捕食功能反應曲線均為典型的無
5、脊椎動物凸型曲線,即HollingⅡ型。
2.利用高通量測序技術對未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨分別進行轉(zhuǎn)錄組測序,使用Trinity軟件,將測序結(jié)果reads進行無參測序數(shù)據(jù)拼接,拼接獲得巴氏新小綏螨的轉(zhuǎn)錄組Unigene,并對Unigene進行功能注釋和GO、KEGG等蛋白質(zhì)功能分類和代謝途徑分析。結(jié)果表明:未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組共獲得52817486對raw data read
6、s共7.92G的測序總量。Trinity拼接結(jié)果獲得23893個基因,86422個轉(zhuǎn)錄本,將拼接獲得23893個gene使用BLAST方法進行基因功能注釋后,其中有7260個注釋到Swiss-Prot庫,13386個注釋到NR庫,7567個注釋到Pfam庫,6078個注釋到KEGG庫,7420注釋到KOG庫,6604注釋到GO庫。添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組共獲得64516490對raw datareads共9.68G的測序總量。
7、Trinity拼接結(jié)果獲得34480個基因,57021個轉(zhuǎn)錄本,將拼接獲得34480個gene使用BLAST方法進行基因功能注釋后,其中有10509個注釋到Swiss-Prot庫,18556個注釋到NR庫,11230個注釋到Pfam庫,8499個注釋到KEGG庫,10735注釋到KOG庫,9664注釋到GO庫。
未添加氨基酸飼養(yǎng)與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨相比,顯著性差異表達的基因共有1291個,其中上調(diào)顯著性差異表達的基因
8、有376個,例如囊泡相關膜蛋白(vesicle-associated membrane protein1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2L3)、天冬氨酰-tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase)等。大多數(shù)的差異表達的基因都是下調(diào)表達(915個),例如熱休克蛋白(heat shock protein)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transf
9、erase)以及小亞基核糖體蛋白(small subunit ribosomal protein S19e)等。本研究對巴氏新小綏螨進行轉(zhuǎn)錄組研究,獲得大量的基因數(shù)據(jù),為從基因分子水平更深層次研究環(huán)境條件對巴氏新小綏螨影響提供支持。
3.在巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出Hsps基因,共獲得21個unigene,熱激蛋白基因家族包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40及小Hsp家族。Hsp90家族有10條、Hsp70
10、家族有7條、Hsp60家族有2條、Hsp40家族及小Hsp家族各有1條。NbHsp90的開放閱讀框為2142bp,編碼713個氨基酸,預測相對分子量為81.9kDa,等電點為5.08;NbHsp60的開放閱讀框為1755bp,編碼583個氨基酸,預測相對分子量為62.2kDa,等電點為5.55;NbHsp40的開放閱讀框為1206bp,編碼401個氨基酸,預測相對分子量為44.7kDa,等電點為6.21。與其它物種中已知的Hsps氨基酸
11、序列進行相似性分析顯示巴氏新小綏螨熱激蛋白基因與西方盲走螨(Metaseiulus occidentalis)和其它昆蟲相應的氨基酸序列具有高度相似性。
4.利用熒光定量PCR技術,分別分析了不同溫度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及43℃處理下,未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨雌成螨體內(nèi)NbHsp90、NbHsp60、NbHsp40三個基因的表達情況。結(jié)果表明,25℃恒溫條件下,未添
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