MTA1蛋白在乳腺癌患者胸水細(xì)胞中的表達(dá)、臨床意義及其與RECK蛋白的相關(guān)性分析.pdf

1、浸潤、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的關(guān)鍵因素。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(metastasis-associated gene1，MTA1)是近年發(fā)現(xiàn)的與信號傳導(dǎo)及基因調(diào)節(jié)有關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在多種惡性腫瘤組織中MTA1過表達(dá)與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各

2、種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。
　　RECK(reversion inducing cysterne rich protein with Kazal motifs)是一種新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移抑制基因。其機(jī)制可能是RECK通過抑制MMP-2、MMP-9及MTI-MMP的分泌活性，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　材料與方法：
　　一、材料
　?。ㄒ唬┡R床資料
　　收集2009年1

3、2月至2012年2月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及病房乳腺癌胸水患者標(biāo)本60例（經(jīng)細(xì)胞免疫化學(xué)及臨床資料證實(shí)為乳腺癌細(xì)胞），另外20例乳腺液基細(xì)胞包埋蠟塊，共計80例。
　?。ǘ┘?xì)胞系
　　一種乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A和兩種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7為低侵襲低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系，MDA-MB-435s為高侵襲高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系)購自北京協(xié)和基地醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。
　?。ㄈ┲饕噭?br>　　山羊抗人MTA1多克隆抗體購自

4、美國Santa公司，RECK兔抗人單克隆抗體購自美國Santa公司，DAB酶底物顯色試劑盒和S-P超敏試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。
　　二、方法
　?。ㄒ唬┟庖呓M織化學(xué)技術(shù)
　　采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法行抗MTA1(1∶100)，RECK(1∶100)免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性乳

5、腺癌切片做陽性對照。
　?。ǘ￤estern blot技術(shù)
　　在三種乳腺癌細(xì)胞系中檢測MTA1，RECK的蛋白水平?？偟鞍讖募?xì)胞系中提取，冰上超聲處理，4℃靜置，孵育50min，4℃離心20min(800r/min)，提取上清，放入-70℃冰箱里保存。使用前，用Brodford法測定蛋白濃度，以每孔80μg蛋白加入10％SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃，50V(MTA1)、100V(RECK)條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0

6、.22μmPVDF膜，5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗(MTA11∶200稀釋，RECK1∶200稀釋)4℃過夜，X底片曝光，顯影，定影后拍照，以β-actin為內(nèi)參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BioImaging Systems，美國)分析蛋白各條帶的灰度值，每組結(jié)果均為相同條件重復(fù)3次。
　?。ㄈ┙y(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理:采用x2檢驗(yàn)（不滿條件時用Fisher確切概率法）分析各組計數(shù)資料，采

7、用Spearman等級相關(guān)分析MTA1蛋白與RECK蛋白組化表達(dá)的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)分析Western Blot圖像灰度值，并用LSD-t檢驗(yàn)對各樣本均數(shù)行兩兩比較，采用Pearson相關(guān)分析兩指標(biāo)Western blot結(jié)果的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、MTA1、RECK在乳腺癌組織中的表達(dá)
　　在60例石蠟標(biāo)本中，MTA1陽性表達(dá)40例(66.66％)定位于細(xì)胞核，RECK陽性表達(dá)2

8、2例(36.66％)主要定位于細(xì)胞漿，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，MTA1蛋白表達(dá)與RECK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，二者的表達(dá)與乳腺癌腫塊大小，組織學(xué)分級，臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　二、MTA1、RECK在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　Western blot檢測，乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-435s中MTA1蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢，而RECK蛋白表達(dá)水平則呈遞減趨勢。
　　結(jié)論：