血紅素氧合酶-1表達(dá)保護(hù)復(fù)蘇后心肌損傷的實驗研究.pdf

1、院外心臟驟停患者初始心肺復(fù)蘇(Cardiopulmonary resuscitation，CPR)成功率約為40％，但大部分初始復(fù)蘇成功的患者死于復(fù)蘇后72小時內(nèi)，心跳驟?；颊咝姆螐?fù)蘇后最終僅有約1.4％—5％能夠生理功能相對正常存活。復(fù)蘇后心功能不全是初期復(fù)蘇成功后數(shù)小時、數(shù)天高致死率的重要原因。保護(hù)心跳驟停全心缺血再灌注損傷的心肌，救治復(fù)蘇后心功能不全，最終改善心肺復(fù)蘇預(yù)后是急診醫(yī)學(xué)研究的重要課題。多種疾病的發(fā)生發(fā)展都是致傷和抗損傷

2、因素相互作用的過程，既往復(fù)蘇后心功能不全的干預(yù)手段多側(cè)重于減輕致?lián)p傷因素，而對于全身缺血再灌注損傷應(yīng)激下的機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制較少涉及。 近些年來，在器官保護(hù)領(lǐng)域的研究中血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)備受關(guān)注。HO-1是血紅素分解代謝的關(guān)鍵限速酶，產(chǎn)生三種重要產(chǎn)物膽紅素、一氧化碳(CO)和Fe2+，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等多重保護(hù)效應(yīng)。多種具有氧化應(yīng)激性質(zhì)的刺激可誘導(dǎo)其表達(dá)，HO-1拮抗細(xì)胞應(yīng)激

3、，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，是重要的內(nèi)源性防御保護(hù)系統(tǒng)，已在器官移植等領(lǐng)域顯示明確保護(hù)效應(yīng)。復(fù)蘇后心功能不全是獨(dú)特的全身缺血再灌注背景下發(fā)生的心肌損傷，可否通過扶持HO-1內(nèi)源性防御保護(hù)系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗損傷、抗應(yīng)激能力，從而保護(hù)復(fù)蘇后心肌不得而知。本研究設(shè)想誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)，探討其對心肺復(fù)蘇大鼠缺血再灌注損傷的心肌及體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并初步闡述其發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。 第一部分血紅素氧合酶-1對心肺復(fù)蘇大鼠心肌缺血

4、 再灌注損傷的保護(hù)作用研究 研究目的： 建立大鼠心跳驟停-心肺復(fù)蘇動物模型，給予血紅素氧合酶-1(HO-1)誘導(dǎo)劑血晶素(Hemin)和抑制劑鋅原卟琳(ZnPP)，研究HO-1在心肺復(fù)蘇大鼠心肌的表達(dá)對復(fù)蘇中心肌缺血再灌注損傷的影響，并從炎癥因子釋放和氧化/抗氧化角度對HO-1在復(fù)蘇后心肌損傷中的可能作用機(jī)制作一探討。 材料和方法： 建立窒息法致大鼠心跳驟停-心肺復(fù)蘇動物模型，應(yīng)用HO-1誘導(dǎo)劑H

5、emin和抑制劑ZnPP預(yù)處理心肺復(fù)蘇大鼠，設(shè)假手術(shù)組、CPR組、Hemin組和Hemin+ZnPP組四個實驗組，每組分復(fù)蘇后6h和24h兩個亞組。采用蛋白免疫印跡和免疫組化方法檢測大鼠心肌HO-1蛋白表達(dá)水平；監(jiān)測大鼠復(fù)蘇后4h內(nèi)的血流動力學(xué)；觀察大鼠復(fù)蘇后心肌酶學(xué)指標(biāo)及心肌超微結(jié)構(gòu)變化。分別采用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化法測定復(fù)蘇大鼠心肌組織勻漿丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，ELISA法檢測大鼠復(fù)蘇后血清腫瘤壞死因

6、子—α(TNF-α)和白細(xì)胞介素—6(IL—6)水平。免疫組化方法檢測大鼠復(fù)蘇后心肌硝基硌氨酸蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、大鼠復(fù)蘇后心肌HO-1表達(dá) 較假手術(shù)組比較，CPR組HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，Hemin進(jìn)一步誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，ZnPP可抑制HO-1表達(dá)。 2、大鼠復(fù)蘇后心功能比較 CPR組復(fù)蘇后反映心室收縮功能和舒張功能的dP/dt40、—dP/dt均顯著低于復(fù)蘇前，Hemin組dP/dt4

7、0復(fù)蘇后無顯著性變化，—dP/dt復(fù)蘇后短暫降低，2h后恢復(fù)至復(fù)蘇前水平。Hemin組復(fù)蘇后各時相dP/dt40、—dP/dt均高于CPR組和Hemin+ZnPP組。 3、大鼠復(fù)蘇后心肌酶學(xué)變化 CPR組復(fù)蘇后血清LDH、CPK—MB明顯升高，復(fù)蘇后6 h及24 h時相亞組，Hemin組CPK—MB、LDH值均低于CPR組及Hemin+ZnPP組。后兩組之間，復(fù)蘇后心肌酶水平無顯著性差異。 4、各組復(fù)蘇后6h心

8、肌超微結(jié)構(gòu)的變化 CPR組復(fù)蘇后心肌線粒體腫脹、灶性空化，嵴模糊不清，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊。Hemin組僅少部分線粒體輕微水腫，嵴清晰，肌絲清晰，復(fù)蘇后心肌超微結(jié)構(gòu)完整性明顯優(yōu)于CPR組。ZnPP抑制HO-1表達(dá)后，心肌損傷加重。 5、大鼠復(fù)蘇后血清炎癥因子變化 與假手術(shù)組比較，CPR組大鼠復(fù)蘇后血清TNF—α、IL—6均明顯升高，Hemin誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增高后，明顯抑制炎癥因子的釋放。Hemin組復(fù)蘇后24h TN

9、F—α水平已接近假手術(shù)組，IL—6水平復(fù)蘇后未見明顯升高。ZnPP抑制HO-1表達(dá)后，Hemin+ZnPP組復(fù)蘇后TNF—α、IL—6水平亦明顯升高，與CPR組水平無顯著性差異。 6、大鼠復(fù)蘇后心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)變化 與假手術(shù)組比較，CPR組復(fù)蘇后6h、24h心肌組織勻漿MDA均升高，SOD降低，心肌組織硝基硌氨酸蛋白表達(dá)明顯增多。Hemin組誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后，心肌MDA降低，SOD升高，明顯抑制心肌硝基硌氨酸蛋白表達(dá)。

10、ZnPP抑制HO-1表達(dá)后，Hemin的保護(hù)作用消失。 結(jié)論： 1、心肺復(fù)蘇中全心缺血再灌注損傷誘導(dǎo)心肌組織HO-1的表達(dá)上調(diào)。 2、Hemin誘導(dǎo)心肌HO-1過表達(dá)，可減輕心肌損傷，保存心肌超微結(jié)構(gòu)完整，改善復(fù)蘇后心功能。 3、HO-1過表達(dá)可抑制復(fù)蘇后炎癥因子的釋放，改善心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能是HO-1對復(fù)蘇后心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。 第二部分血紅素氧合酶-1對缺氧再復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)

11、作用研究 研究目的： 在體外原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷模型，在體外試驗中模擬心肺復(fù)蘇過程中的心肌缺血再灌注損傷過程。在細(xì)胞水平證實誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)，對缺氧再復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞是否有保護(hù)效應(yīng)，并初步探討其機(jī)制。 材料和方法： 酶消化法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，采用無糖、無血清、0.5％O2培養(yǎng)2h，恢復(fù)糖、血清及氧供應(yīng)6h建立心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷模型。應(yīng)用Hemin和ZnPP缺氧前24h

12、預(yù)處理心肌細(xì)胞，設(shè)正常對照組(C組)、缺氧再復(fù)氧組(HR組)、Hemin組及Hemin+ZnPP組。采用采用蛋白免疫印跡和免疫組化方法檢測心肌細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)；觀察細(xì)胞再復(fù)氧后上清LDH水平，胎盤蘭染色觀察心肌細(xì)胞活力；觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化。測定細(xì)胞上清MDA和SOD水平，以及TNF—α、IL—6水平。免疫組化方法檢測心肌細(xì)胞再復(fù)氧6h硝基硌氨酸蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 采用酶消化法

13、原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)α—橫紋肌肌動蛋白細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定心肌細(xì)胞純度為90.5±1.4％，培養(yǎng)至第4天心肌細(xì)胞搏動頻率180次/min左右。 2、心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷模型建立 心肌細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，0.5％O2、無糖、無血清培養(yǎng)2h，恢復(fù)糖、血清及氧供應(yīng)正常培養(yǎng)6h，胎盤蘭染色示心肌細(xì)胞活力降低，搏動減慢，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，電鏡下見線粒體腫脹，嵴斷裂，肌絲模糊。缺氧再復(fù)氧處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)明顯損傷。

14、 3、心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后HO-1表達(dá) 蛋白免疫印跡和免疫組化方法證實心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧后HO-1表達(dá)增高，Hemin處理進(jìn)一步升高HO-1表達(dá)，ZnPP抑制HO-1表達(dá)。 4、缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞活力變化 HR組缺氧再復(fù)氧后LDH釋放增多，胎盤蘭染色細(xì)胞存活率明顯下降，Hemin預(yù)處理誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)，降低缺氧再復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH釋放，提高細(xì)胞存活率。ZnPP抑制HO-1表達(dá)，阻斷Hemin的保護(hù)作用。

15、 5、心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后病理形態(tài)變化 HR組缺氧再復(fù)氧后，細(xì)胞損傷重，線粒體腫脹、空泡變性，嵴溶解消失，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂。Hemin處理誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)，明顯保持心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧后形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的完整性，ZnPP可阻斷其保護(hù)效應(yīng)。 6、心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后炎癥因子水平 HR組細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞上清TNF—α、IL—6水平升高，Hemin處理誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)降低細(xì)胞缺氧復(fù)氧后TNF—α、I

16、L—6的釋放。 7、心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后氧化應(yīng)激指標(biāo) HR組細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞上清MDA水平增高，SOD降低，免疫細(xì)胞化學(xué)示硝基硌氨酸蛋白表達(dá)增高。Hemin誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)可降低MDA，升高SOD，降低硝基硌氨酸蛋白表達(dá)。ZnPP抑制HO-1表達(dá)后，可阻斷Hemin的保護(hù)作用。 結(jié)論： 1、成功建立較好模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷的體外心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷模型。 2、心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧誘導(dǎo)HO-1