雷公藤內(nèi)酯醇毒性作用的研究及茅蒼術(shù)提取物對其減毒作用的初步探討.pdf

1、雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）又名雷公藤甲素是從衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，具有十分廣泛的藥理作用，如抗生育，抗腫瘤，抗白血病，抗炎和免疫抑制活性。但由于TP治療窗較窄，其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重的毒副反應(yīng)的限制，如肝毒性，免疫毒性，腎毒性，生育和生殖毒性等，因此，如何保持其生物活性，降低其不良反應(yīng)是函待解決的問題。本文采用C57BL/6這一“標(biāo)準(zhǔn)”

2、自交系小鼠，探討長期應(yīng)用TP對C57BL/6小鼠全身主要組織功能的毒性影響及在其體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究，為更深入地研究TP的毒性作用與其在體內(nèi)代謝規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本文進(jìn)一步通過分別給予C57BL/6小鼠茅蒼術(shù)水提取物和揮發(fā)油成分，評價其對小鼠肝臟CYP3A的表達(dá)水平的影響及對TP的毒性作用影響的研究，通過茅蒼術(shù)與TP聯(lián)合應(yīng)用以研究其減毒作用機(jī)制。此外，本文還通過Ames實(shí)驗(yàn)方法對雷公藤多苷片的遺傳毒性進(jìn)行檢測，以獲取進(jìn)一步的毒理學(xué)數(shù)據(jù)

3、，并為其臨床安全合理用藥提供基礎(chǔ)資料。
　　1.雷公藤內(nèi)酯醇對C57BL/6小鼠亞慢性毒性作用的研究探討長期應(yīng)用TP對C57BL/6小鼠全身主要組織功能的毒性影響，為更好的研究TP臨床毒性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。采用C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為3組。分別腹腔注射給藥0，100，200μg/kg TP，每48h一次，連續(xù)30 d。每周稱重，觀察小鼠體重變化。采用ELISA試劑盒法測定小鼠血清中ALT、AST以及BUN含量并檢測肝組織勻漿

4、中ALT、AST、GSH和腎組織勻漿中GSH含量;求臟器指數(shù);病理組織切片H&E染色法觀察C57BL/6小鼠肝臟、腎、胃、肺、睪丸、脾、十二指腸等組織。與正常對照組相比，低劑量組小鼠體質(zhì)量到第28天時增長體質(zhì)量明顯降低(P＜0.05)，高劑量組小鼠在給藥后第21天和第28天時，增長體質(zhì)量顯著降低(P＜0.01）;與正常對照組比較，高劑量組小鼠血清中的BUN含量有較顯著提高，增長34.5％(P＜0.05);與正常對照組比較，高劑量組肝組織

5、和腎組織中的GSH含量分別降低了27.0％和15.80％，P＜0.05有顯著性差異;與正常對照組比較，低劑量組與高劑量組小鼠睪丸臟器指數(shù)分別由（0.86±0.04）％降低到（0.63±0.07）％和（0.48±0.10）％(P＜0.01），此外高劑量組小鼠脾臟臟器指數(shù)增加（P＜0.05），其他臟器指數(shù)無顯著性差異;觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠低劑量組與高劑量組小鼠腎、脾臟、睪丸均有明顯損傷，高劑量組損傷更嚴(yán)重。長期應(yīng)用TP對C

6、57BL/6小鼠全身主要組織功能有一定的影響，尤其對小鼠腎、脾臟和睪丸功能有較強(qiáng)的毒性作用。
　　2.UPLC測定C57BL/6小鼠血漿中雷公藤內(nèi)酯醇濃度及藥動學(xué)研究建立測定C57BL/6小鼠血漿中TP濃度的UPLC法，探討TP在C57BL/6小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)過程。采用超高效液相法對經(jīng)HCl酸化并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取后的血漿樣品進(jìn)行分析，流動相:乙腈-水(30-70)，流速:0.2 ml/min，檢測波長為218 nm。將C

7、57BL/6小鼠分為0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kgTP三個劑量給藥組，測定各時間點(diǎn)TP在血漿中的含量，并計算相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)。在0.02～1.0μg/ml濃度范圍內(nèi)血漿中TP線性關(guān)系良好，日內(nèi)和日間差異RSD均小于10％，平均提取回收率高于85％。低、中、高三個給藥劑量小鼠，血漿中TP的藥時曲線為二室開放模型，低、中、高三個劑量的分布相半衰期(T1/2α)分別為11.27、7.84、6.78 min，消除半衰期

8、(T1/2β)分別為693.41，122.34，92.04 min。采用UPLC法測定血漿中的TP，迅速，簡便，準(zhǔn)確性高，專屬性強(qiáng)，可用于TP在體內(nèi)藥動學(xué)的研究以及大批量生物樣品的準(zhǔn)確定量分析。
　　3.茅蒼術(shù)提取物誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肝臟CYP3A對雷公藤內(nèi)酯醇減毒作用的影響
　　探討茅蒼術(shù)提取物對C57BL/6小鼠肝臟CYP3A的表達(dá)水平的影響及其對TP的減毒增效作用影響。方法(1)茅蒼術(shù)提取物對C57BL/6小鼠肝臟

9、CYP3A蛋白表達(dá)水平的影響:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為四組，分別設(shè)為正常對照組，茅蒼術(shù)揮發(fā)油組、水提物組、苯巴比妥誘導(dǎo)組。劑量依次為:正常對照組，按體質(zhì)量給予相當(dāng)量生理鹽水;茅蒼術(shù)揮發(fā)油組和水提物組按20g/kg分別灌胃給藥(20g/kg為生藥量);苯巴比妥組，按80mg/kg，灌胃給藥苯巴比妥溶液。末次給藥后，制備小鼠肝微粒體，采用蛋白免疫印跡法檢測肝臟CYP3A蛋白含量。(2) TP單用及與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)用對C56BL/7小鼠亞

10、慢性毒性作用的影響:將小鼠完全隨機(jī)分為四組，每組10只:生理鹽水，正常對照組;TP單獨(dú)給藥組(300μg/kg); TP與茅蒼術(shù)水提物低劑量聯(lián)用組（300μg/kg，10g/kg）;TP與茅蒼術(shù)水提物高劑量聯(lián)用組（300μg/kg，20g/kg）。采用ELISA試劑盒法檢測小鼠血清、肝和腎組織勻漿中的各項(xiàng)生化指標(biāo);求臟器指數(shù);病理組織切片H&E染色法觀察C57BL/6小鼠肝臟、腎、脾、睪丸。(3) TP單用及與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)用的抗炎作用

11、比較:取小鼠40只C56BL/7小鼠隨機(jī)分為四組，1％吐溫-80，正常對照組;TP單獨(dú)給藥組(300μg/kg);TP與茅蒼術(shù)水提物低劑量聯(lián)用組（300μg/kg，10g/kg）;TP與茅蒼術(shù)水提物高劑量聯(lián)用組(300μg/kg，20g/kg)，連續(xù)給藥7d。末次給藥后1小時，采用二甲苯致小鼠右耳廓發(fā)炎，左耳為正常對照，以左右耳片質(zhì)量差作為腫脹度，并計算抑制率。茅蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠CYP3A蛋白表達(dá)無明顯誘導(dǎo)作用而茅蒼術(shù)水提物組對CYP3

12、A蛋白表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用;TP單用及與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)用對C56BL/7小鼠亞慢性毒性作用的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TP單用組血清中ALT、AST及BUN含量均有顯著上升，而GSH含量顯著下降，小鼠肝腎脾睪丸均有損傷，TP與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)合給藥組與正常對照組相比，血清中ALT，AST，GSH及BUN含量均無顯著性差異，并且小鼠肝、腎、脾及睪丸組織病理切片顯示損傷較小。TP單用及與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)用后的抗炎效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TP與茅蒼術(shù)水提物組小

13、鼠耳腫脹度與空白組相比無顯著性差異，并且抑制率高于TP單用組。茅蒼術(shù)水提物組對CYP3A蛋白表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用，TP與茅蒼術(shù)水提物聯(lián)合給藥可降低其毒性作用并且抗炎作用優(yōu)于TP單獨(dú)給藥。
　　4.基于AMES試驗(yàn)的雷公藤多苷片致突變性的遺傳毒理學(xué)研究對雷公藤多苷片進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)，以評價其遺傳毒性。采用直接平皿摻入法，將雷公藤多苷片以每皿160，500，1600，2500μg雷公藤多苷為終濃度在活化與非活化條件下，分別與鼠傷寒