Beagle犬毒性試驗(yàn)中腎毒性生物標(biāo)志物研究與D青霉胺致Brown Norway大鼠自身免疫疾病模型的建立.pdf

1、第一部分：Beagle犬毒性試驗(yàn)中腎毒性生物標(biāo)志物研究
　　研究目的：
　　隨著新藥的不斷上市，臨床上藥物導(dǎo)致的急性腎損傷的報(bào)道越來越多，急性腎損傷作為藥物的不良反應(yīng)之一引起人們的廣泛關(guān)注，然而在新藥臨床前腎毒性研究中，傳統(tǒng)的腎損傷標(biāo)志物，如血肌酐和尿素氮等的敏感性低和特異性差，不能較好的對(duì)新藥潛在的腎臟毒性進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。因此，近年來，尋找并確證能夠早期診斷腎臟損傷的生物標(biāo)志物已經(jīng)成為腎臟毒理學(xué)研究的發(fā)展方向。2008年6月

2、，F(xiàn)DA和EMEA推薦了7個(gè)新型腎臟毒性生物標(biāo)志物，但這些生物標(biāo)志物的研究主要基于嚙齒類動(dòng)物，鑒于犬和人類的相似性高及犬在安全性評(píng)價(jià)中的廣泛使用，腎毒性標(biāo)志物在犬中卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用Beagle犬建立腎損傷模型，探索并尋找敏感性和特異性高的新型腎損傷標(biāo)志物，為臨床前藥物腎毒性評(píng)價(jià)提供新的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　研究方法：
　　參考相關(guān)文獻(xiàn)建立犬急性腎損傷模型，Beagle犬連續(xù)肌肉注射硫酸慶大霉素（80mg/kg）9天，以血清中

3、傳統(tǒng)標(biāo)志物血肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）及腎臟病理損傷為標(biāo)準(zhǔn)，建立腎毒性模型；對(duì)收集到的6h尿液樣本檢測(cè)腎損傷因子1（Kim-1）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、叢生蛋白(Clusterin)、白介素18(IL18)、骨橋蛋白(OPN)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿總蛋白(uTP)，血清進(jìn)行半胱氨酸抑制酶 C(CysC)檢測(cè)，采用受試者工作曲線方法將上述新的潛在腎毒性標(biāo)志物與傳統(tǒng)標(biāo)志物血肌酐和尿素氮

4、進(jìn)行分析，找尋靈敏度和特異度都較優(yōu)的新型腎毒性生物標(biāo)志物；此外，在動(dòng)物解剖時(shí)自膀胱采集解剖時(shí)間點(diǎn)尿液進(jìn)行上述指標(biāo)的檢測(cè)，研究隨機(jī)采尿時(shí)間點(diǎn)采尿方法用于評(píng)價(jià)腎毒性的可行性；同時(shí)提取腎臟組織 mRNA，在 mRNA水平對(duì)腎損傷標(biāo)志物進(jìn)行研究。
　　研究結(jié)果：
　　1、6h時(shí)間段尿中腎毒性生物標(biāo)志物的研究
　　與對(duì)照組相比，血 CRE、BUN、尿 NAG、clustrin、NGAL和uTP隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度呈升高趨勢(shì)，

5、有時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，且 NAG、clusterin、NGAL和uTP在早期就有顯著性變化。
　　血 BUN、CRE、尿 NAG、NGAL、uTP和clusterin的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.731、0.851、0.947、1.000、0.822和1.000。
　　2、解剖點(diǎn)尿中腎毒性生物標(biāo)志物的研究
　　與對(duì)照組相比，uTP隨著給藥時(shí)間升高而升高，但無顯著性變化，NAG于第3天就有顯

6、著性升高，NGAL于第6天有顯著性升高，clustrin于第3天已有顯著性升高，NAG、NGAL和clustrin的升高呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；
　　血 BUN、CRE、尿 NGAL、clusterin、NAG和uTP的曲線下面積分別為0.827、0.920、1.000、1.000、0.907和0.947。
　　3、相關(guān)標(biāo)志物 mRNA水平的研究
　　隨給藥天數(shù)的增加，Kim-1，clusterin，NGAL的mRNA表達(dá)倍數(shù)

7、的增加，Kim-1在第3，6和9天相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別是2.2倍，14.4倍和41.6倍，NGAL在第3，6和9天相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別是0.45倍，5.32倍和5.42倍，變化最大的是clusterin，其在第3，6和9天相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別是4.2倍，155.0倍和281.7倍。
　　結(jié)論：
　　1、研究表明，6h尿液樣本中 NAG、NGAL、clusterin新型標(biāo)志物相對(duì)于傳統(tǒng)腎毒性標(biāo)志物及腎臟病理變

8、化結(jié)果，能在早期對(duì)急性腎損傷進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　2、隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)尿液中相關(guān)標(biāo)志物也能夠預(yù)測(cè)急性腎損傷，且采尿方法更為便捷。
　　3、在慶大霉素誘導(dǎo)的犬急性腎損傷模型中，Kim-1的mRNA的表達(dá)逐漸升高，推測(cè) Kim-1蛋白可能在 Beagle犬尿液中的含量也可能逐漸增加，可能作為評(píng)價(jià)犬急性腎損傷的潛在標(biāo)志物，有待進(jìn)一步研究。NGAL的mRNA并未出現(xiàn)立即升高的現(xiàn)象，與 NGAL蛋白在尿中的升高不一致，推測(cè)尿中蛋白的升高可能是已合

9、成的NGAL蛋白釋放所致。clusterin的mRNA的表達(dá)升高和尿中 clusterin蛋白升高相一致。
　　第二部分：D青霉胺致Brown Norway大鼠自身免疫疾病模型的建立
　　研究目的：
　　建立 D青霉胺誘導(dǎo)的BN大鼠的自身免疫疾病模型，并研究模型中抗核抗體的發(fā)生、發(fā)展情況，為臨床前抗核抗體檢測(cè)方法的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為3組，D青霉胺對(duì)照組（灌胃給予450mg/kg

10、 D青霉胺），PolyIC聯(lián)合D青霉胺給藥組或聯(lián)合給藥組（灌胃給予450mg/kg D青霉胺前肌肉注射10mg/kg的PolyIC），去離子水組，每周給藥6次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，從第二周開始，每周采血2次，進(jìn)行抗核抗體檢測(cè)，在 D青霉胺組抗核抗體產(chǎn)生時(shí)，D青霉胺組抗核抗體達(dá)峰時(shí)進(jìn)行兩次解剖，取心、肝、脾、肺、腎等進(jìn)行病理學(xué)觀察并稱重，解剖前取血和收集尿液進(jìn)行生化和尿蛋白分析，給藥每天進(jìn)行臨床癥狀觀察。
　　研究結(jié)果：
　　1、給

11、藥第12天起，聯(lián)合給藥組有動(dòng)物出現(xiàn)耳紅腫，耳緣增厚的癥狀，D青霉胺組從給藥第13天起，部分動(dòng)物出現(xiàn)耳紅腫，耳緣增厚癥狀，并隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，D青霉胺組及聯(lián)合給藥組患病動(dòng)物數(shù)逐漸增加，癥狀加重，出現(xiàn)癥狀包括耳部和面部輕微潰瘍，結(jié)痂，腳趾紅腫等。
　　2、各組動(dòng)物在整個(gè)給藥期間體重基本保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，聯(lián)合給藥組動(dòng)物體重在第5周時(shí)與對(duì)照組相比顯著降低。首次解剖時(shí)（給藥第15天），D青霉胺組和聯(lián)合給藥組脾臟重量與對(duì)照組相比顯著增大。第二次

12、解剖時(shí)（給藥第31天），D青霉胺組出現(xiàn)心臟、脾臟、肺臟和腎臟重量的顯著升高，聯(lián)合給藥組出現(xiàn)心臟、肝臟及脾臟重量的顯著升高，胸腺重量顯著減少。
　　3、首次解剖時(shí)（給藥第15天），D青霉胺組 ALP，LDH，CHO，ALB，Na+，CL-及聯(lián)合給藥組 AST，ALP，TBIL，Na+，CL-與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第二次解剖時(shí)（給藥第31天），D青霉胺組 ALP、ALB及聯(lián)合給藥組 ALP，LDH，CRE，Na+與對(duì)照組相比有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)差異。
　　4、抗核抗體滴度的升高與自身免疫癥狀和病變的嚴(yán)重程度具有一致性。
　　5、聯(lián)合給藥組出現(xiàn)自身免疫相關(guān)癥狀的時(shí)間早于 D青霉胺組且誘發(fā)的癥狀較 D青霉胺組來說更嚴(yán)重。
　　結(jié)論：
　　1、在國(guó)內(nèi)首次建立 D青霉胺誘導(dǎo) BN大鼠的自身免疫模型。
　　2、D青霉胺在 BN大鼠和人體內(nèi)均可誘發(fā)自身免疫疾病的發(fā)生，D青霉胺誘發(fā)的BN大鼠自身免疫疾病模型可用于毒性生物標(biāo)志物、自身免疫的發(fā)病機(jī)制和藥物臨床