CD98與炎癥性腸病發(fā)展的相關(guān)性及黃芩湯的干預(yù)作用研究.pdf

1、背景：
　　 炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一種頑固難治的消化道疾病，其進(jìn)一步發(fā)展能夠引起結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)，而且惡變率很高。CD98是近年來(lái)研究炎癥和腫瘤的一個(gè)熱點(diǎn)，最初被認(rèn)為是T細(xì)胞活化的標(biāo)志，最近的研究發(fā)現(xiàn)它在調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和固有免疫中具有非常重要的作用，因此CD98很可能成為預(yù)防和治療IBD的一個(gè)重要的藥物靶點(diǎn)，但CD98在IBD中發(fā)病

2、中的作用并不完全清楚，尚需要深入探討。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD98在IBD患者結(jié)腸組織中的表達(dá)增高，而在CRC患者結(jié)腸組織中的表達(dá)更高，說(shuō)明CD98異常表達(dá)可能參與了IBD的發(fā)生發(fā)展甚至癌變的過(guò)程，但其在IBD和CRC中確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
　　 CD98（CD98重鏈;編碼SLC3A2）是Ⅱ型跨膜蛋白，它通過(guò)共價(jià)鍵與L型氨基酸載體（輕鏈）結(jié)合，形成具有一定功能的二聚體，CD98是T細(xì)胞活化的標(biāo)志，并具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)

3、的功能，CD98在除血小板外的所有細(xì)胞中均有表達(dá)，在胃腸道和腎小管中表達(dá)更高。雖然CD98的異常表達(dá)與許多疾病密切相關(guān)，如炎癥性腸病、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌等，但目前我們對(duì)CD98在腸上皮細(xì)胞中的功能還知之甚少。
　　 雖然很多學(xué)者在CD98功能的體外實(shí)驗(yàn)中取得了一定研究成果，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究仍然不夠全面，而且CD98在腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)中的確切作用機(jī)制還不清楚，結(jié)合其他學(xué)者的研究成果，我們推測(cè)CD98在IBD發(fā)生發(fā)展中可能的機(jī)制是:

4、全身免疫失衡所導(dǎo)致的腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)和黏膜損傷，引起腸上皮細(xì)胞中CD98異常表達(dá)，CD98異常表達(dá)影響結(jié)腸上皮細(xì)胞中整聯(lián)蛋白β1(CD29)的信號(hào)傳導(dǎo)，打破了細(xì)胞增殖和存活的平衡，導(dǎo)致腸道通透性增加，引起并加重腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)期的炎癥刺激，細(xì)胞異常增殖最終引發(fā)CRC。為了證實(shí)這一推測(cè)，明確CD98在IBD中的作用機(jī)制，本研究以IBD患者、CRC患者和小鼠為研究對(duì)象，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究CD98在IBD發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制以及CD98在上皮

5、細(xì)胞中的功能，從而進(jìn)一步完善IBD的發(fā)病機(jī)制，也為新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 目前，臨床常用的治療IBD的藥物主要有糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸類(lèi)藥物、免疫抑制劑、靶向生物免疫治療、炎性介質(zhì)抑制劑以及抗生素等。雖然使用這些藥物可能會(huì)在短期內(nèi)起效，但長(zhǎng)期應(yīng)用就會(huì)產(chǎn)生一定的副作用，從而影響患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)是多途徑、多層次、多靶點(diǎn)，同時(shí)副作用很少，以往的臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典方劑黃芩湯治療IBD療效確切，但其治療IB

6、D的藥效機(jī)制目前還尚未完全明確，因此，有必要對(duì)該方進(jìn)行深入探討。
　　 綜上所述，本研究以IBD患者、CRC患者和小鼠為研究對(duì)象，探討CD98與IBD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及CD98在結(jié)腸中的功能，并選用經(jīng)典名方黃芩湯作為干預(yù)藥物，進(jìn)一步研究IBD的發(fā)病機(jī)制以及黃芩湯治療IBD的作用機(jī)理。本研究的成果將為進(jìn)一步闡明IBD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，也為合理開(kāi)發(fā)IBD的治療藥物提供支持。
　　 目的：
　　 觀察CD98在I

7、BD患者和CRC患者結(jié)腸組織和腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況并深入探討CD98與IBD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及CD98在結(jié)腸上皮細(xì)胞中的功能，并探討黃芩湯對(duì)CD98的干預(yù)作用及其機(jī)制。
　　 方法
　　 1.患者入選及分組:IBD患者入選標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》;CRC患者入選標(biāo)準(zhǔn)參考《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010年版)》，CRC患者要求具有IBD的病史。患者分組:結(jié)合入選標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為3組:健康組(n=5);

8、炎癥性腸病組（IBD組，n=6）;結(jié)直腸癌組（CRC組，n=8）。
　　 2.動(dòng)物造模及分組:小鼠腸炎造模方法:將飲用水中加入葡聚糖硫酸鈉(dextransodium sulfate，DSS)，制成3.5％ DSS溶液給小鼠自由飲用，連續(xù)7天;小鼠腸炎造模過(guò)程中抑制CD98功能方法:在使用小鼠腸炎造模方法中同時(shí)每天腹腔注射0.5mg/ml CD98山羊抗鼠多克隆抗體(antiCD98)，0.5mg/kg，連續(xù)7天。分組(1):

9、C57BL/6小鼠18只，隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(Control，n=6):自由飲水，每天腹腔注射生理鹽水0.5mg/kg，連續(xù)7天。造模組(DSS，n=6):使用小鼠腸炎造模方法。造模結(jié)合抗體組（DSS+antiCD98，n=6）:使用小鼠腸炎造模過(guò)程中抑制CD98功能方法;分組(2): C57BL/6小鼠32只，隨機(jī)分為4組:Control(n=8)、DSS組(n=8)、DSS+黃芩湯組(n=8)、DSS+美沙拉嗪組(n=8)。

10、>　　 3.治療方案:小鼠黃芩湯給藥量:一劑黃芩湯按照70g計(jì)算，小鼠給藥量為9.1 g/kg·d，小鼠美沙拉嗪給藥量0.52g/kg·d。將藥物按照每日兩次每次0.1ml的灌胃量制成溶液，按照小鼠體重計(jì)算藥量給藥。
　　 4.DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型評(píng)價(jià):每天記錄大鼠的飲食、飲水、體重、糞便、毛色、活動(dòng)和精神狀態(tài)等一般情況，記錄大鼠體重變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后評(píng)價(jià)大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)及組織病理學(xué)評(píng)分、記錄小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、取結(jié)腸組織勻

11、漿檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性。
　　 5.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組臨床患者結(jié)腸組織中CD98和小鼠結(jié)腸組織中CD98、Ki67的蛋白表達(dá)水平。
　　 6.Western blot法檢測(cè)各組臨床患者結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD98的蛋白表達(dá)水平和小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD98、p-FAK、p-Erk1/2、p-Akt的蛋白表達(dá)水平。
　　 7.免疫沉淀法結(jié)合Westem blot法檢測(cè)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD98與整聯(lián)蛋白β1

12、(CD29)的作用情況。
　　 8.免疫熒光法檢測(cè)小鼠血清中異硫氰酸熒光素葡聚糖含量。
　　 9.細(xì)胞因子芯片篩選與CD98表達(dá)密切相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子。
　　 10.ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中前炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、INF-γ含量。
　　 11.Real-Time PCR法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中趨化因子MCP-1、MIP-3α mRNA的表達(dá)。
　　 12.TUNEL法檢測(cè)小鼠

13、結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡程度。
　　 統(tǒng)計(jì)方法
　　 實(shí)驗(yàn)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS for windows)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多組間比較采用單向方差分析（one-way ANOVA），首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)多重比較采用LSD方法檢驗(yàn)，如方差不齊時(shí)采用近似F檢驗(yàn)Welch法進(jìn)行方差分析，多重比較采用Dunnett's T3方法檢驗(yàn);重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差

14、分析的方法進(jìn)行比較，若滿足球形檢驗(yàn)則無(wú)需矯正，若不滿足球形檢驗(yàn)，則用Greenhouse-Geisser校正系數(shù)來(lái)矯正自由度;結(jié)腸組織病理評(píng)分多組比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.與健康組比較，CD98在IBD患者結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)意義（免疫組織化學(xué)結(jié)果:P＜0.001，Western blot結(jié)果:P=0.003），CD98在CRC患者結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞增高（免疫組織化學(xué)結(jié)果:P＜0.001，Western blot結(jié)果:P＜0.001）;IBD組與CRC組比較，CRC組結(jié)腸中CD98的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（免疫組織化學(xué)結(jié)果:P＜0.001，Western blot結(jié)果:P=0.001）。
　　 2.在小鼠腸炎模型中，與Control組比較，

16、DSS組和DSS+antiCD98組結(jié)腸中CD98的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（免疫組化結(jié)果:P＜0.001，P=0.008;Western blot結(jié)果:P=0.002，P=0.040）;體重降低;結(jié)腸顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001）;結(jié)腸組織中MPO活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，P=0.021);組織病理學(xué)評(píng)分顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P=0.009）;血清中FITC的含量

17、顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.001);結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和INF-γ含量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001; P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）;結(jié)腸組織中MCP-1和MIP-3α mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P=0.001; P＜0.001，P=0.003）;結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD29的蛋白含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

18、＜0.001，P=0.005）;DSS組p-Erk1/2、p-FAK和p-Akt的蛋白含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P=0.012，P=0.006），DSS+antiCD98組p-FAK蛋白含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）;結(jié)腸組織中Ki67的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.005)。
　　 3.在小鼠腸炎模型中，與DSS組比較，DSS+antiCD98組結(jié)腸中CD98的表達(dá)降低，

19、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(免疫組化結(jié)果:P=0.010，Western blot結(jié)果:P=0.003);體重增高;結(jié)腸長(zhǎng)度增加(P＜0.001);結(jié)腸組織中MPO活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）;組織病理學(xué)評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）;血清中FITC的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）;結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和INF-γ含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.00

20、1);結(jié)腸組織中MCP-1和MIP-3α mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033，P=0.017）;結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD29的蛋白含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);結(jié)腸上皮細(xì)胞中p-Erk1/2的蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）;
　　 4.Control組、DSS組和DSS+antiCD98組各組中細(xì)胞凋亡情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.459，P=0.641)。
　　 5.黃芩

21、湯對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型的療效評(píng)價(jià):與DSS組比較，DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組均能夠緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的疾病嚴(yán)重程度，經(jīng)7天的治療后，DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組小鼠鼠精神好轉(zhuǎn)，毛色漸有光澤，食欲增加，動(dòng)作增多，反應(yīng)靈活，大便成型較多，少見(jiàn)稀軟糞便，體重增加;各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001）;DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組的MPO活性及組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低，與DS

22、S組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001）。與DSS組比較，DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和INF-γ的含量顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001;P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）;與DSS組比較，DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組MCP-1和MIP-3α mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P=0.019; P＜0.001，P

23、=0.031）。
　　 6.DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組腸組織中CD98的表達(dá)顯著降低，與DSS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（免疫組化結(jié)果:P＜0.001，P＜0.001;Western blot結(jié)果:P＜0.001，P=0.001）。
　　 7.DSS+黃芩湯組和DSS+美沙拉嗪組血清中FITC的含量降低，與DSS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001）。
　　 8.DSS+黃芩湯組和DSS+

24、美沙拉嗪組結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD29的含量降低，與DSS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001， P＜0.001）。
　　 9.黃芩湯和美沙拉嗪能夠抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞中p-Erk1/2、p-FAK和p-Akt的蛋白表達(dá)，與DSS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p-Erk1/2: P＜0.001; p-FAK:P=0.031,P=0.014; p-Akt: P=0.001,P=0.002）。
　　 10.黃芩湯組和美沙拉嗪組中Ki67的

25、表達(dá)與DSS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P=0.725，P=0.285)。
　　 結(jié)論
　　 1.CD98在IBD患者結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞表達(dá)增高，在CRC患者結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞顯著增高，CD98是IBD和CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子之一。
　　 2.在小鼠腸炎模型中，CD98加重小鼠腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)的機(jī)制是:DSS介導(dǎo)的小鼠腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、INF-γ和趨化因子MCP-1、

26、MIP-3α表達(dá)增高，引起結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD98異常高表達(dá)，CD98通過(guò)與CD29相互作用，促進(jìn)MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路中FAK、Akt和Erk1/2的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞異常過(guò)度增殖，Ki67表達(dá)增高，從而加重了腸上皮屏障功能破壞程度，加重了腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)。但確切的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
　　 3.黃芩湯能夠?qū)SS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型起到一定的治療作用，能夠降低其炎癥程度，并對(duì)過(guò)度表達(dá)