重金屬Cu2+脅迫下花斑裸鯉鈣調蛋白磷酸酶的應答及其分子調節(jié)機理.pdf

1、花斑裸鯉（Gymnocypris eckloni）是分布在青藏高原黃河上游特有魚類，它不僅具有開發(fā)利用的經(jīng)濟價值，更是黃河上游水域中生物多樣性的重要組成部分，具有重要的生態(tài)保護價值。近十多年來，隨著高原工農業(yè)發(fā)展和人為活動的增強，青海省漁業(yè)水域環(huán)境中重金屬監(jiān)測指標在某些監(jiān)測斷面的某個時間點上有接近甚至超過漁業(yè)水質標準的現(xiàn)象，對野生花斑裸鯉存在潛在的影響。因此有必要了解花斑裸鯉在重金屬脅迫下的應答機制，并找到一些生物分子作為生物標志物來準

2、確、快速監(jiān)測水域環(huán)境質量，為黃河上游水域中魚類的保護和恢復提供理論依據(jù)。
　　本研究通過反轉錄 PCR（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）和快速末端擴增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）方法克隆了6條基因，分析了這些基因在花斑裸鯉組織的表達分布特征；采用實時熒光定量 PCR（real-time fluores

3、cence quantitative PCR, Real time PCR）方法，對在 Cu2+濃度為0.01 mg/L脅迫下花斑裸鯉肝臟、腎臟和鰓組織中白細胞介素1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）和金屬硫蛋白（ Metallothionein, MT）轉錄水平應答模式進行了分析；利用Real time PCR和 Western bl

4、ot方法對鈣調蛋白磷酸酶（Calcineurin, CN）轉錄水平和蛋白水平的表達模式進行了研究，初步推斷CN及其信號通路參與了 Cu2+脅迫下花斑裸鯉免疫調節(jié)。結果如下：
　　（1）克隆得到了 CN大小亞基（CNAα、CNAγ和 CNB）、MT、IL-1β和TNF-α的全長cDNA序列，分別命名為 Ge-CNAα（KX772783）、Ge-CNAγ（KX772785）、Ge-CNB（KX772784）、Ge-MT、Ge-IL-1

5、β（KX772786）和Ge-TNF-α（KX772787）；RT-PCR結果表明 IL-1β、TNF-α、MT、CNAα、CNAγ和CNB在各組織中表現(xiàn)出差異性表達的分布特征。
　?。?）Cu2+脅迫72小時內，肝臟、腎臟和鰓組織中 MT表達水平比對照組均有所升高，其中，腎臟中的表達量最高，其次是肝臟和鰓；IL-1β和 TNF-α表達水平先下降后上升。初步斷定在 Cu2+濃度為0.01 mg/L時，會誘導花斑裸鯉免疫反應的發(fā)生，

6、 MT、IL-1β和TNF-α參與該免疫調節(jié)。
　?。?）Cu2+脅迫72小時內，肝臟、腎臟和鰓中的 CN大小亞基表達量均呈現(xiàn)增加的趨勢；但CNAα蛋白表達量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，表明CN在Cu2+脅迫下產生了應答。推測 CN可能通過 NF-AT/NF-κB通路或者結合 MT上游調控元件 CN依賴性應答元件（CDRE）來調控下游基因IL-1β、TNF-α和 MT的表達。
　　本研究結果表明，CN及其相關基因在機體應答重金