體外研究銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞活性.pdf

1、背景：銀屑病是由多種原因所致的慢性炎癥性皮膚病，T細(xì)胞已被認(rèn)為是促發(fā)銀屑病細(xì)胞與分子生物學(xué)炎性網(wǎng)絡(luò)并最終導(dǎo)致皮損形成的重要因素。臨床研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，應(yīng)用免疫抑制劑阻斷或抑制T細(xì)胞活性后可取得取得治療效果，顯示皮損或外周血T細(xì)胞均可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，而銀屑病T細(xì)胞皮下注射于人皮膚-SCID鼠嵌合體誘發(fā)銀屑病皮損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則為體現(xiàn)T細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中重要作用的更直接的證據(jù)。日益增多的證據(jù)表明，銀屑病是一多種致病基因協(xié)同

2、作用且具有極強(qiáng)遺傳傾向的皮膚病，單卵雙生子同患率高達(dá)60％。雖然多種因素均可激活免疫系統(tǒng)導(dǎo)致病理性T細(xì)胞的產(chǎn)生，但強(qiáng)烈且復(fù)雜的遺傳背景提示內(nèi)源性因素在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮極其重要的作用。此外，在銀屑病的整個(gè)發(fā)病過(guò)程中不僅僅是T細(xì)胞活性和數(shù)量的改變，還涉及其它免疫細(xì)胞，如銀屑病患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等眾多免疫細(xì)胞甚至紅細(xì)胞及血小板均存在數(shù)量及功能的異常。由于所有免疫細(xì)胞均源自骨髓造血細(xì)胞，結(jié)合骨髓移植可消增銀屑

3、病的報(bào)道，故有理由認(rèn)為銀屑病患者免疫異?？赡芘c由骨髓造血細(xì)胞活性有關(guān)。 目的： 1.檢測(cè)銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞高增殖潛能集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)、紅系集落形成單位(CFU-E)及粒-巨噬系集落形成單位(CFU-GM)集落形成狀況，并進(jìn)一步探討銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)上清對(duì)骨髓造血細(xì)胞集落形成的影響，揭示銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞活性及其與外周血免疫異常間的關(guān)系； 2.將銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞體

4、外定向分化為成熟T細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞活性以反映骨髓造血細(xì)胞在T細(xì)胞異常免疫活性形成中的作用，以進(jìn)一步揭示骨髓與銀屑病發(fā)病間的關(guān)系。 方法和結(jié)果：1.銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞體外集落形成分析a.銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞HPP-CFC、CFC-E及CFC-GM分析：密度梯度離心法分離骨髓單一核細(xì)胞(BMMNC)，采用甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)法研究銀屑病患者及正常人骨髓HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM集落形成。結(jié)果顯示銀屑病患者

5、的HPP-CFC及CFU-GM的集落形成數(shù)較正常對(duì)照顯著減少，而CFU-E集落數(shù)與正常對(duì)照比較無(wú)顯著差異。 b.銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清對(duì)骨髓HPP-CFC、CFC-E及CFC-GM的影響：將銀屑病患者及正常對(duì)照PBMC培養(yǎng)上清加入正常人骨髓HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM培養(yǎng)體系，觀察銀屑病患者PBMC對(duì)骨髓造血活性的影響。結(jié)果顯示銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清作用后，HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM集落形成數(shù)較

6、自然增殖組及正常人PBMC培養(yǎng)上清作用組顯著減少；而正常人PBMC培養(yǎng)上清作用組與自然增殖組無(wú)顯著差異。 2.銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞體外定向分化的T細(xì)胞活性研究a胸腺基質(zhì)細(xì)胞支持下骨髓造血細(xì)胞向T細(xì)胞體外定向分化：免疫磁珠法分離骨髓CD34+細(xì)胞，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液構(gòu)建的微環(huán)境下，在胸腺基質(zhì)細(xì)胞的支持下，使其體外向T細(xì)胞定向分化，收集培養(yǎng)的非貼壁細(xì)胞，免疫熒光染色后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間CD1-CD3+細(xì)胞、CD3+

7、CD4+CD8-細(xì)胞及CD3+CD4-CD8+細(xì)胞比例，建立穩(wěn)定的骨髓造血細(xì)胞向T細(xì)胞定向分化的方法。結(jié)果顯示，培養(yǎng)1周時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞中以不成熟的CD1+CD3-細(xì)胞、CD1+CD3+細(xì)胞為主，可檢測(cè)到少量CD1-CD3+細(xì)胞，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，不成熟細(xì)胞比例逐漸減少，而成熟的CD1-CD3+細(xì)胞比例逐漸增加；在CD3+細(xì)胞中，培養(yǎng)初期以不成熟的雙陽(yáng)性細(xì)胞CD4+CD8+為主，而成熟的單陽(yáng)性CD4+CD8-細(xì)胞及CD4-CD8+細(xì)胞占極小比

8、例，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，雙陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸減少，而成熟的雙陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸降低；而無(wú)胸腺基質(zhì)細(xì)胞支持的CD34+細(xì)胞僅在培養(yǎng)初期檢測(cè)到成熟細(xì)胞存在，而培養(yǎng)后4周基本檢測(cè)不到成熟T細(xì)胞的存在。 b銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞體外定向分化的T細(xì)胞增殖活性及分泌細(xì)胞因子水平研究：免疫磁珠法分離家族史陽(yáng)性銀屑病患者及正常對(duì)照骨髓CD34+細(xì)胞，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液構(gòu)建的微環(huán)境下，在胸腺基質(zhì)細(xì)胞的支持下，使其體外向T細(xì)胞定向分化，免疫磁珠法收集

9、CD3+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD8-細(xì)胞及CD4-CD8+細(xì)胞比例。分別采用MTT法及ELISA法檢測(cè)自然增殖組及鏈球菌超抗原(SAg)刺激后T細(xì)胞增殖活性及分泌細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，經(jīng)骨髓CD34+細(xì)胞定向分化并擴(kuò)增的CD3+T細(xì)胞中可檢測(cè)到CD4+CD8-、CD4-CD8+T細(xì)胞，且銀屑病患者組及正常對(duì)照組CD4+CD8-及CD4-CD8+T細(xì)胞比例無(wú)顯著差異；銀屑病患者骨髓CD34+細(xì)胞定向分化的T細(xì)胞自然增殖組及SA

10、g刺激組增殖活性均顯著高于正常人對(duì)照組；銀屑病患者T細(xì)胞自然增殖組培養(yǎng)上清IL-4、IL-8及IFN-γ與正常對(duì)照無(wú)顯著差異，SAg刺激后IL-4表達(dá)水平無(wú)顯著改變，而IL-8及IFN-γ水平卻顯著高于正常人。 c銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞體外定向分化的T細(xì)胞對(duì)KCc-myc、bcl-xL、p53及ki67蛋白表達(dá)的影響：在胸腺基質(zhì)細(xì)胞的支持下，將銀屑病患者骨髓CD34+細(xì)胞體外定向分化為T(mén)細(xì)胞，收集T細(xì)胞并采用IL-2、PHA及S

11、Ag進(jìn)一步擴(kuò)增及活化T細(xì)胞，將T細(xì)胞與KC共培養(yǎng)，分別采用SP免疫組化法及ELISA法檢測(cè)KCc-myc、bcl-xL、p53及ki67蛋白表達(dá)及培養(yǎng)上清中IL-8、IFN-γ水平。結(jié)果顯示，受銀屑病患者造血細(xì)胞定向分化的T細(xì)胞作用的KCc-myc及Ki67蛋白表達(dá)與自然增殖組及正常人造血細(xì)胞定向分化的T細(xì)胞作用組相比顯著增強(qiáng)，而bcl-xL及p53蛋白表達(dá)三組間無(wú)顯著差異；受正常人T細(xì)胞作用的KCc-myc、bcl-xL、p53及Ki

12、67蛋白表達(dá)與自然增殖組比較差異無(wú)顯著性；銀屑病造血細(xì)胞定向分化的T細(xì)胞作用組培養(yǎng)上清IL-8及IFN-γ水平顯著高于正常對(duì)照。 結(jié)論：1.銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞HPP-CFC及CFU-GM集落形成能力顯著低于正常對(duì)照，進(jìn)一步研究表明銀屑病患者PBMC上清可顯著抑制骨髓HPP-CFC、CFU-E、CFU-GM集落形成，表明銀屑病患者骨髓造血細(xì)胞增殖活性顯著降低，可能在一定程度上和外周血免疫異常所致的骨髓造血微環(huán)境改變有關(guān)，提示骨