基于基因表達譜芯片技術的金納米粒子分子生物相容性機理研究.pdf

1、納米生物材料具有許多優(yōu)良的理化特性，在生物醫(yī)學領域的應用日益廣泛，為了使納米生物材料在生物系統中的應用更加安全有效，建立納米材料安全性評價的標準體系，研究納米材料與細胞作用的機制越來越得到各界的重視。金納米粒子作為一種納米生物材料，在疾病診斷、藥物載體、腫瘤治療等許多生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用。目前，關于金納米粒子的分子生物相容性的研究還很少。本論文的研究目的是在金納米粒子與細胞相互作用的檢測基礎上，采用基因表達譜芯片技術結合生物信息學

2、分析，對金納米粒子與人皮膚成纖維細胞（HumanDermalFibroblasts-fetal，HDF-f）的分子生物相容性機理進行研究。通過探索研究納米材料與機體相互作用的機理的新途徑，為建立基于基因表達譜芯片技術的納米材料分子生物相容性評價的新方法打下基礎。本論文的具體工作如下：
　　 1）采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備20nm納米金溶膠并進行表征?？疾?00μM，20nm納米金與HDF-f細胞作用1h、4h和8h后的情況。應

3、用流式細胞術研究了納米金對細胞周期和凋亡的影響，結果表明納米金有促進S期細胞增加而G2/M期細胞減少的趨勢。
　　 2）應用Illumina基因組表達譜芯片獲得200μM，20nm納米金與HDF-f細胞作用1h、4h和8h后差異基因表達情況，按照Illumina表達譜芯片篩選原則，1h、4h和8h這3個實驗組中的差異表達基因分別為1212個，384個和492個，共計不重復具有GeneID的基因1794個。應用熒光定量RT-PCR

4、實驗對4個差異表達基因進行驗證，驗證基因的表達情況與基因表達譜實驗一致。
　　 3）應用Cluster&TreeView軟件對200μM，20nm納米金作用HDF-f細胞1h、4h和8h后1794個基因進行聚類分析，按照差異表達基因的表達模式分為6簇。應用GoSurfer軟件和DAVID數據庫對6簇基因分別進行基因本體論（GeneOntology，GO）功能分類分析，發(fā)現具有類似表達模式的基因所涉及的基因在功能上有一定的相關性。

5、應用GoSurfer軟件對全部1794個差異表達基因按照生物學過程、分子功能、細胞組分結構層級進行GO功能分類研究。結果表明納米金可能廣泛影響細胞的生物學過程，細胞的核酸結合水平，轉錄因子的活性可能會有所改變，細胞內氧化還原狀態(tài)和相應酶及受體活性、蛋白復合體和與DNA的復制有關的過程可能會受到影響。
　　 4）應用GenMAPP軟件，對200μM，20nm納米金作用HDF-f細胞1h、4h和8h后的全部差異表達基因參與的生物學途

6、徑進行分析，在GenMAPP數據庫中找到的差異表達基因共有1740個，共得到包含差異表達基因的MAPPs90個，對其中25個MAPPs代表的生物學途徑進行了詳細討論，包括17個在本課題小組前期基于蛋白質組學實驗的金納米粒子分子生物相容性機理研究結果中篩選出的途徑，5個差異表達基因數目較多及所占途徑總基因數的比例較高的途徑以及3個與細胞周期有關的途徑。將差異表達基因在生物學途徑中所起到的作用與它們的表達模式和GO功能分類的分析結合起來，綜

7、合進行分析。
　　 5）應用IngenuityPathwayAnalysis（IPA）分析平臺對200μM，20nm納米金處理HDF-f細胞1h，4h和8h后發(fā)生差異表達的1794個基因進行分析，得到基因相互作用網絡。對打分值最高的前5個網絡進行具體分析。
　　 6）綜合對差異表達基因的聚類、GO、生物學途徑和基因相互作用網絡分析，對納米金與細胞相互作用的分子機理進行總結，納米金與細胞作用的具體機制及其可能引起的主要生物

8、學效應包括：納米金可能會誘導細胞產生氧化應激，引起細胞內肌動蛋白骨架調控狀態(tài)的改變，影響細胞的形態(tài)、粘附與遷移，納米金可能對mRNA加工、細胞周期、能量代謝、受體信號傳導等生物學過程產生影響。將本論文的研究結果與國內外納米金生物相容性研究現狀相比較，本論文除了得到了一些其他研究小組已經獲得的納米金與細胞相互作用關系可能的結論，還得到了一些其他研究小組未曾報道過的納米金可能產生的其它生物學效應。將本論文的研究結果與本課題小組前期有關鎳離子

9、誘導的細胞毒性機理研究結論相比較，發(fā)現不同的生物材料與細胞作用后，雖然產生主要的細胞效應具有相似之處，但不同材料表現出不同的內在作用機理和基因調控方式，結合基因表達譜芯片和生物信息學分析方法，可以為研究細胞與材料作用的分子機理提供一種具有特異性和有效性的研究手段。與本課題小組前期基于蛋白質組學實驗的金納米粒子分子生物相容性機理研究中獲得的差異表達蛋白質數據相比，盡管差異表達基因和蛋白在數量上有較大差異，但是差異表達基因和蛋白質所涉及的主