P300-CBP相關因子在腸型胃癌中的表達及功能研究.pdf

1、P300/CBP相關因子(P300/CBP associated factor，PCAF)是哺乳動物中第一個被報道的組蛋白乙酰化轉移酶，目前研究認為PCAF通過調節(jié)組蛋白和非組蛋白水平而與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關聯。PCAF的發(fā)現為GNAT家族，即GCNS相關的N端乙?；D移酶(GCNS-relatad-acetytransferas，GNAT)，在細胞中的正確定位提供了良好的解釋，為腫瘤的分子機理研究和預后判斷提供了新的思路，有望作為腫瘤

2、預后判斷的一個新的標志物。PCAF基因在腫瘤中的研究目前尚是一個新的領域，迄今為止國內外尚無有關于胃癌中PCAF的實驗研究報道。鑒于以上原因，本實驗擬研究PCAF基因在腸型胃癌中的表達情況，通過胃腺癌細胞株SGC-7901構建能夠穩(wěn)定表達外源基因PCAF的胃癌細胞系，在此基礎上，觀察PCAF基因轉染對胃癌細胞體內體外生長的抑制作用并探討其可能機理，為胃癌的診斷和治療提供新的思路和理論依據。
　　 第一部分PCAF在人腸型胃癌組織

3、和胃腺癌細胞系中的表達
　　 目的：研究PCAF在人腸型胃癌組織和胃腺癌細胞系中的表達情況及其與臨床病理的相關性，以初步探討PCAF在人胃癌中表達的生物學意義。
　　 方法：采用Western blot方法檢測永生化人胃粘膜上皮細胞株GES-1和人胃癌細胞株SGC-7901，MKN-45，AGS中PCAF的表達。在406例臨床病理資料完整的腸型胃癌及對應癌旁正常胃組織標本中，采用免疫組織化學染色法檢測PCAF在組織學水平

4、的表達，結合臨床病理資料對實驗結果統(tǒng)計分析。
　　 結果：
　　 1.Western-blot檢測提示胃腺癌細胞株中PCAF蛋白呈低至痕量表達，而永生化胃粘膜上皮細胞株GES-1中PCAF為高表達；
　　 2.在腸型胃癌組織中，PCAF的表達與胃壁侵犯、腫瘤瘤體大小、TNM分期、p21、pRb(P＜0.001)，PCNA相關(P＜0.01)；
　　 3.PCAF在腸型胃癌組織中的表達下調與突變型p53密切

5、相關(P＜0.01)；
　　 4.單因素分析顯示PCAF/wt p53的患者較其他組合類型的患者有更好的臨床預后(P＜0.0001)；
　　 5.多因素分析顯示，腫瘤的部位，淋巴結轉移，PCAF/p53表型，＜0.0001)，胃壁侵犯(P=0.001)和PCNA(P=0.018)是判斷腸型胃癌預后的獨立預后因子。
　　 結論：PCAF特異性下調表達于腸型胃癌組織，可能引起胃癌腫瘤細胞中全組蛋白水平的下調和下游基因

6、的轉錄失活并可能通過影響腫瘤相關的非組蛋白，參與胃癌發(fā)生演進的過程。PCAF與突變型p53的聯合檢測有助于在臨床判斷腸型胃癌患者的預后。
　　 第二部分pcDNA3.1-PCAF重組載體的構建及轉染細胞的生物學效應
　　 目的：應用定向基因克隆技術，構建PCAF基因真核表達載體pcDNA3.1-PCAF，建立并鑒定能穩(wěn)定表達外源PCAF基因的胃癌細胞系以研究PCAF基因對SGC-7901細胞生物學行為的影響及其可能的機理

7、。
　　 方法：
　　 1.(1)從美國ATCC哺乳動物基因組獲得PCAF克隆(克隆號10435572)；
　　 (2)通過對pBluescriptR酶切分離獲得PCAF的cDNA插入全長，并通過定向克隆技術構建PCAF基因真核表達載體pcDNA3.1-PCAF；
　　 (3)對重組體pcDNA3.1-PCAF進行鑒定；
　　 (4)測序結果重組體所含DNA序列與Genebank公布PCAF序列號

8、比對，結果一致。
　　 2.將PCAF基因的真核表達質粒pcDNA3.1-PCAF和空載體pcDNA3.1質粒分別轉化細菌、擴增提取純化后，應用脂質體Lipo2000介導的方法分別轉染體外培養(yǎng)的p53突變型胃腺癌細胞系SGC-7901。G418篩選陽性克隆并擴增培養(yǎng)傳代。鑒定穩(wěn)轉基因，并同時檢測其下游效應分子p21、pRb等的表達。
　　 3.以成功構建的分別能穩(wěn)定表達外源pcDNA3.1-PCAF、空載體pcDNA3.

9、1的胃癌細胞系和未轉染質粒載體的SGC-7901細胞為研究對象，通過MTT比色、軟瓊脂克隆集落形成等一系列細胞學功能實驗及TUNEL染色的形態(tài)學觀察，探索穩(wěn)定轉染細胞株中PCAF的表達對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響。
　　 結果：
　　 1.(1)應用脂質體將質粒pcDNA3.1順利導入大腸桿菌DH5α內，且轉化效率高。
　　 (2)酶切電泳結果顯示pcDNA3.1質粒被EcoRI、Acc65I成功雙酶切。
　

10、　 (3)RT-PCR方法擴增的插入片段電泳證實擴增的片段即為目的片段。重組質粒酶切鑒定預期目的條帶。
　　 (4)測序結果重組體所含DNA序列與Genebank公布PCAF序列比對，結果一致。
　　 2.重組體pcDNA3.1-PCAF轉染細胞株和空載體pcDNA3.1轉染細胞株均獲得氨芐青霉素抗性。重組體pcDNA3..1-PCAF轉染細胞株和空載體pcDNA3.1轉染細胞株因攜帶有Neor擴標簽，均檢測到Neor

11、的表達，證實轉染成功。Westernblot顯示重組體pcDNA3.1-PCAF轉染細胞株中目的基因PCAF在蛋白質水平上表達均較空載體轉染細胞株和未轉染細胞株顯著增強。
　　 3.對轉染前后的細胞觀察表明，重組體轉染組細胞生長減慢，克隆形成率降低，裸鼠體內成瘤受到抑制，但凋亡變化不明顯。
　　 結論：
　　 1.應用基因克隆技術成功構建PCAF基因真核表達載體pcDNA3.1-PCAF。
　　 2.成功