神經(jīng)肽S在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達及其對睡眠-覺醒和認(rèn)知功能影響的研究.pdf

1、睡眠是人類不可缺少的生理過程。睡眠不僅可以維持個體生存及正常的生理功能，還具有促進生長發(fā)育、易化學(xué)習(xí)、形成記憶的功能。睡眠和覺醒是一個包括復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路和多種神經(jīng)化學(xué)成分的行為反應(yīng)。神經(jīng)遞質(zhì)在此過程中發(fā)揮了極其重要的作用。神經(jīng)肽S(neuropeptide S，NPS)是在2004年最新研究發(fā)現(xiàn)的一種與睡眠和覺醒相關(guān)的神經(jīng)肽，其相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體即為神經(jīng)肽S受體(neuropeptideS receptor，NPSR)。最早的研究發(fā)現(xiàn)

2、，神經(jīng)肽S廣泛分布在脊椎動物(人、小鼠、大鼠、雞、猩猩、牛)中，在成年大鼠的腦組織、甲狀腺、唾液腺和乳腺中都較高表達。神經(jīng)肽S與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮其生理作用，能夠調(diào)節(jié)睡眠覺醒、減少驚恐發(fā)作、影響攝食行為、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及變態(tài)反應(yīng)等。而其中尤以它與睡眠/覺醒方面的作用最為突出和明確。由于神經(jīng)肽S發(fā)現(xiàn)時間較晚，目前對于神經(jīng)肽S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布及功能研究很少，僅有少數(shù)研究報道。
　　 為進一步深入對神經(jīng)肽S功能的認(rèn)識，本研究首先

3、系統(tǒng)研究了神經(jīng)肽S在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達和分布特點，為深入研究其功能打下基礎(chǔ)。在此實驗中，我們對大鼠腦組織和脊髓做連續(xù)切片，首次全面研究神經(jīng)肽S在大鼠整個神經(jīng)系統(tǒng)中的表達分布情況。其次，鑒于神經(jīng)肽S已被發(fā)現(xiàn)的最主要的作用——調(diào)節(jié)睡眠/覺醒的作用，首次研究了不同時程REM期睡眠剝奪后大鼠下丘腦內(nèi)神經(jīng)肽S的表達變化，以期進一步研究神經(jīng)肽S與睡眠覺醒的關(guān)系。最后，首次研究了中樞給予神經(jīng)肽S是否可以改善REM睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠認(rèn)知功能損害，

4、并探索其可能的分子機制。
　　 本研究使用免疫組織化學(xué)、原位雜交技術(shù)研究神經(jīng)肽S蛋白和mRNA在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達和分布特點。實驗結(jié)果顯示，神經(jīng)肽S廣泛分布于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，且免疫組織化學(xué)結(jié)果和原位雜交結(jié)果具有高度一致性。在嗅球、初級嗅皮質(zhì)區(qū)域，神經(jīng)肽S均呈陽性染色，陽性染色主要集中在細(xì)胞胞體，證實神經(jīng)肽S可能參與中樞嗅覺系統(tǒng)的興奮傳遞過程。神經(jīng)肽S強陽性染色集中在大腦運動皮質(zhì)區(qū)、軀體感覺皮質(zhì)區(qū)、梨狀皮質(zhì)和嗅皮質(zhì)，尤其

5、是在運動皮質(zhì)區(qū)、軀體感覺皮質(zhì)區(qū)第V層存在致密染色，提示神經(jīng)肽S可能參與神經(jīng)局部環(huán)路的構(gòu)建。在海馬中，在CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞的胞體和軸突均呈現(xiàn)不同程度的神經(jīng)肽S陽性染色，提示神經(jīng)肽可能參與海馬的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，也可能與認(rèn)知功能有關(guān)。在丘腦的很多神經(jīng)核團中，尤其是前腹側(cè)核、前內(nèi)側(cè)核、前背側(cè)核和腹外側(cè)核中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽S廣泛表達；在下丘腦的室旁核和背內(nèi)側(cè)核也有神經(jīng)肽S陽性神經(jīng)元表達。神經(jīng)肽S在這些部位的分布提示它可能參與機體多種生理活動，

6、包括調(diào)節(jié)體溫、水鹽代謝、活動能力、飲食、睡眠/覺醒和激素分泌等。在腦干中，神經(jīng)肽S受體強陽性染色分布在藍斑、外側(cè)臂旁核、三叉神經(jīng)中腦核、三叉神經(jīng)運動核。在小腦皮質(zhì)中，浦肯野細(xì)胞中神經(jīng)肽S陽性染色最強，幾乎所有的浦肯野細(xì)胞均為陽性染色。致密染色集中在細(xì)胞胞體和軸突上。在脊髓頸部、胸部、腰部、骶部灰質(zhì)區(qū)均有神經(jīng)肽S陽性細(xì)胞分布，在背角染色較強。
　　 其次，使用免疫組織化學(xué)、原位雜交、RT-PCR等技術(shù)觀察不同時程REM睡眠剝奪對大

7、鼠下丘腦神經(jīng)肽S蛋白及mRNA表達量的影響。將成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(CC)、環(huán)境對照組(TC)、REM睡眠剝奪組(SD)，每組又分為1天、3天、5天組。采用改良多平臺水環(huán)境睡眠剝奪法(MMPM)建立大鼠的REM睡眠剝奪模型，完成相應(yīng)時間的REM睡眠剝奪后，測定大鼠下丘腦神經(jīng)肽S表達量的變化。免疫組織化學(xué)及原位雜交結(jié)果顯示：在REM期睡眠剝奪后，下丘腦的背內(nèi)側(cè)核和室旁核的NPS蛋白和mRNA表達發(fā)生改變。在這兩個核團，CC組

8、和TC組的NPS表達較少，散在分布于核團中。而REM期睡眠剝奪1天后，大鼠背內(nèi)側(cè)核和室旁核NPS蛋白和mRNA陽性細(xì)胞數(shù)仍較少。到REM期睡眠剝奪的第3天，可以觀察到大鼠背內(nèi)側(cè)核和室旁核NPS蛋白和mRNA陽性細(xì)胞數(shù)量均增多，在REM期睡眠剝奪的第5天，仍呈現(xiàn)這樣的趨勢。RT-PCR結(jié)果顯示，CC組和TC組下丘腦內(nèi)NPSmRNA的表達量很少，在REM期睡眠剝奪1天后，大鼠下丘腦的NPSmRNA的表達也較少。而在REM期睡眠剝奪3天和5天

9、組，大鼠下丘腦中NPSmRNA的表達量較CC組，TC組和SD1天組明顯升高。
　　 最后，我們研究了中樞給予神經(jīng)肽S對REM睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠認(rèn)知功能損害是否有改善作用，并探索其可能的分子機制。SD大鼠隨機分為正常對照組(CC)、環(huán)境對照組(TC)、REM睡眠剝奪組(SD)，其中每組又分為神經(jīng)肽S側(cè)腦室給藥組(NPS)和人工腦脊液對照組(aCSF)?？偣卜譃榱M：CC-aCSF組，TC-aCSF組，SD-aCSF組，CC-NPS

10、組，TC-NPS組和SD-NPS組。睡眠剝奪時間為72小時。各組大鼠側(cè)腦室置管，恢復(fù)后采用改良多平臺水環(huán)境睡眠剝奪法(MMPM)建立大鼠的REM睡眠剝奪模型，同時側(cè)腦室給予神經(jīng)肽S或人工腦脊液。選用Morris水迷宮的定位航行實驗對所有大鼠進行空間認(rèn)知學(xué)習(xí)能力的測定，72小時的REM睡眠剝奪結(jié)束后，利用Morris水迷宮的空間探索實驗測定大鼠的空間記憶能力。迷宮測試完畢，運用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)等方法

11、測定大鼠海馬磷酸化的CREB(p-CREB)表達的變化。實驗結(jié)果表明：72小時REM期睡眠剝奪后，大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力與正常對照和環(huán)境對照組的大鼠相比明顯減退；正常對照組與環(huán)境對照組大鼠的空間記憶能力無明顯差異(p＞0.05)；CC-NPS組大鼠和TC-NPS組大鼠的空間記憶能力比CC-aCSF組和TC-aCSF組有所提高，而空間學(xué)習(xí)能力無差別；SD-NPS組大鼠的空間記憶能力較SD-aCSF組明顯增強，空間學(xué)習(xí)能力也有所提高；72

12、小時REM期睡眠剝奪后，大鼠海馬的p-CREB表達下降，SD-NPS組大鼠海馬的p-CREB表達量較SD-aCSF組增高。
　　 本課題聯(lián)合使用免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)，首次系統(tǒng)研究了神經(jīng)肽S蛋白和mRNA在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達和分布特點，發(fā)現(xiàn)該神經(jīng)肽廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，在皮質(zhì)、杏仁核、海馬、丘腦、下丘腦、腦干、脊髓、嗅球都有分散表達。提示神經(jīng)肽S可能參與多種神經(jīng)生理活動。首次研究了REM期睡眠剝奪后，大鼠下

13、丘腦內(nèi)NPS蛋白和mRNA的表達變化情況，發(fā)現(xiàn)在持續(xù)REM期睡眠剝奪狀態(tài)下，下丘腦內(nèi)的NPS表達增加，證實了NPS與覺醒的相互關(guān)系，在受到外天刺激無法正常睡眠時，機體會自身調(diào)節(jié)，分泌足量的NPS來維持覺醒。我們還發(fā)現(xiàn)，REM睡眠剝奪對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有損害作用，神經(jīng)肽S可以緩解REM期睡眠剝奪造成的認(rèn)知功能損傷，REM期睡眠剝奪后，海馬的p-CREB表達下調(diào)，NPS可以部分逆轉(zhuǎn)睡眠剝奪引起的p-CREB表達下調(diào)。提示神經(jīng)肽S可能通過